O ṣeun fun lilo si Nature.com.Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin.Fun awọn abajade to dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹya tuntun ti aṣawakiri rẹ (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Lakoko, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a n ṣafihan aaye naa laisi aṣa tabi JavaScript.
Awari ati anfani ti awọn ọja adayeba le ṣe iranlọwọ fun ilọsiwaju igbesi aye eniyan.Awọn kemikali inhibitory idagbasoke ọgbin jẹ lilo pupọ bi awọn herbicides lati ṣakoso awọn èpo.Nitori iwulo lati lo awọn oriṣiriṣi awọn oogun herbicides, iwulo wa lati ṣe idanimọ awọn agbo ogun pẹlu awọn ilana iṣe tuntun.Ninu iwadi yii, a ṣe awari aramada N -alkoxypyrrole yellow, coumamonamide, lati Streptomyces werraensis MK493-CF1 ati ṣeto ilana iṣelọpọ pipe.Nipasẹ awọn idanwo iṣẹ ṣiṣe ti ibi, a ṣe awari pe urs-monoamic acid jẹ agbedemeji sintetiki ti urs-monoamide ati agbara kanoludena idagbasoke ọgbin.Ni afikun, a ti ṣe agbekalẹ ọpọlọpọ awọn itọsẹ urbenonic acid, pẹlu itọsẹ urbenyloxy (UDA), eyiti o ni iṣẹ ṣiṣe herbicidal giga laisi ni ipa odi ni idagbasoke awọn sẹẹli HeLa.A tun rii pe awọn itọsẹ urmotonic acid dabaru awọn microtubules ọgbin;ni afikun, KAND yoo ni ipa lori awọn filaments actin ati ki o fa iku sẹẹli;Awọn ipa ọna pupọ wọnyi yatọ si awọn ti awọn inhibitors microtubule ti a mọ ati daba ilana iṣe tuntun fun ursonic acid, eyiti o jẹ aṣoju anfani pataki ni idagbasoke awọn herbicides tuntun.
Awari ati ohun elo iṣe ti awọn ọja adayeba anfani ati awọn itọsẹ wọn jẹ ọna ti imudarasi didara igbesi aye eniyan.Awọn metabolites keji ti iṣelọpọ nipasẹ awọn microorganisms, awọn ohun ọgbin ati awọn kokoro ti yori si awọn ilọsiwaju pataki ni oogun ati iṣẹ-ogbin.Ọpọlọpọ awọn egboogi ati awọn oogun egboogi-aisan lukimia ti ni idagbasoke lati awọn ọja adayeba.Ni afikun, orisirisi orisi tiipakokoropaeku, fungicides ati herbicides ti wa ni jade lati awọn wọnyi adayeba awọn ọja fun lilo ninu ogbin.Ni pataki, awọn ohun elo egboigi iṣakoso igbo jẹ awọn irinṣẹ pataki fun jijẹ awọn eso irugbin ni iṣẹ-ogbin ode oni, ati pe awọn oriṣiriṣi awọn agbo ogun ti lo tẹlẹ ni iṣowo.Ọpọlọpọ awọn ilana cellular ni awọn irugbin, gẹgẹbi photosynthesis, iṣelọpọ amino acid, iṣelọpọ ogiri sẹẹli, ilana ti mitosis, ifihan agbara phytohormone, tabi iṣelọpọ amuaradagba, ni a gba pe awọn ibi-afẹde aṣoju ti herbicides.Awọn akojọpọ ti o dẹkun iṣẹ microtubule jẹ kilasi ti o wọpọ ti awọn herbicides ti o ni ipa lori idagbasoke ọgbin nipasẹ ni ipa lori ilana mitotic2.
Microtubules jẹ awọn paati ti cytoskeleton ati pe o wa ni ipamọ pupọ ninu awọn sẹẹli eukaryotic.tubulin heterodimer ni ninu α-tubulin ati β-tubulin ti o n ṣe awọn ilana ilana microtubule laini, pẹlu awọn ilana 13 ti o n ṣe agbekalẹ silindrical kan.Microtubules ṣe awọn ipa pupọ ninu awọn sẹẹli ọgbin, pẹlu ipinnu apẹrẹ sẹẹli, pipin sẹẹli, ati gbigbe intracellular3,4.Awọn sẹẹli ohun ọgbin ni awọn microtubules labẹ awo inu pilasima interphase, ati pe awọn ohun ti a pe ni awọn microtubules cortical ni a ro lati ṣakoso iṣeto ti microfibrils cellulose nipasẹ ilana ti awọn eka sẹẹli synthase cellulose4,5.Awọn microtubules cortical ti awọn sẹẹli epidermal root, ti o wa ni agbegbe ti elongation iyara ti sample root, wa ni ita, ati awọn microfibers cellulose tẹle awọn microtubules wọnyi ati diwọn itọsọna ti imugboroosi sẹẹli, nitorinaa igbega elongation sẹẹli anisotropic.Nitorinaa, iṣẹ microtubule ni ibatan pẹkipẹki si imọ-jinlẹ ọgbin.Awọn aropo Amino acid ninu awọn jiini fifi koodu tubulin fa skew ti awọn akojọpọ microtubule cortical ati idagbasoke osi- tabi apa ọtun ni Arabidopsis 6,7.Bakanna, awọn iyipada ti o wa ninu awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu microtubule ti o ṣe atunṣe awọn iṣiro microtubule le tun ja si idagbasoke root ti o daru8,9,10,11,12,13.Ni afikun, itọju pẹlu microtubule-disrupting herbicides gẹgẹbi disopyramide, ti a tun mọ ni pretilachlor, tun fa idagbasoke root oblique ti apa osi14.Awọn data wọnyi fihan pe ilana deede ti iṣẹ microtubule jẹ pataki fun ṣiṣe ipinnu itọsọna ti idagbasoke ọgbin.
Awọn oriṣiriṣi awọn inhibitors microtubule ni a ti ṣe awari, ati pe awọn oogun wọnyi ti ṣe awọn ilowosi pataki si iwadii cytoskeletal, ati si iṣẹ-ogbin ati oogun2.Ni pato, oryzalin, awọn agbo ogun dinitroaniline, disopyramide, awọn agbo ogun ti o niiṣe pẹlu benzamide, ati awọn analogs wọn le dẹkun iṣẹ microtubule ati nitorina o dẹkun idagbasoke ọgbin.Nitorina, wọn ti wa ni o gbajumo ni lilo bi herbicides.Sibẹsibẹ, niwon awọn microtubules jẹ ẹya pataki ti ọgbin ati awọn sẹẹli eranko, ọpọlọpọ awọn inhibitors microtubule jẹ cytotoxic si awọn iru sẹẹli mejeeji.Nitorinaa, laibikita iwulo ti a mọ bi awọn herbicides, nọmba to lopin ti awọn aṣoju antimicrotubule ni a lo fun awọn idi iṣe.
Streptomyces jẹ iwin ti idile Streptomyces, eyiti o pẹlu aerobic, gram-positive, kokoro arun filamentous ati pe o jẹ olokiki pupọ fun agbara rẹ lati gbejade ọpọlọpọ awọn metabolites atẹle.Nitorinaa, o jẹ ọkan ninu awọn orisun pataki julọ ti awọn ọja adayeba ti nṣiṣe lọwọ biologically tuntun.Ninu iwadi ti o wa lọwọlọwọ, a ṣe awari agbo-ara tuntun kan ti a npe ni coumamonamide, eyiti o ya sọtọ lati Streptomyces werraensis MK493-CF1 ati S. werraensis ISP 5486. Lilo iṣiro spectral ati imọran kikun, ilana ti coumamonamide ni a ṣe afihan ati alailẹgbẹ N-alkoxypyrrole skeleton. ti pinnu.kolaginni.Ursmonic acid, agbedemeji sintetiki ti ursmonoamide ati awọn itọsẹ rẹ, ni a rii lati ṣe idiwọ idagbasoke ati germination ti ọgbin awoṣe olokiki Arabidopsis thaliana.Ninu iwadi ibatan iṣe-iṣe, a rii pe idapọ kan pẹlu C9 ti a yipada si ursonic acid, ti a pe ni itọsẹ nonyloxy ti ursonic acid (KAND), ṣe pataki ni imudara ipa inhibitory lori idagbasoke ati germination.Ni pataki, oludena idagbasoke ọgbin ti a ṣẹṣẹ ṣe awari tun ni ipa lori idagba ti taba ati liverwort ati pe kii ṣe cytotoxic si awọn kokoro arun tabi awọn sẹẹli HeLa.Pẹlupẹlu, diẹ ninu awọn itọsẹ urmotonic acid fa phenotype root ti o daru, ti o tumọ si pe awọn itọsẹ wọnyi taara tabi ni aiṣe-taara ni ipa lori awọn microtubules.Ni ibamu pẹlu ero yii, awọn akiyesi wa ti awọn microtubules ti a samisi boya immunohistochemically tabi pẹlu awọn ọlọjẹ fluorescent tọkasi pe itọju KAND depolymerizes microtubules.Ni afikun, itọju pẹlu awọn itọsẹ acid kumamotonic ṣe idalọwọduro awọn microfilaments actin.Nitorinaa, a ti ṣe awari oludena idagbasoke ọgbin tuntun eyiti ọna ṣiṣe alailẹgbẹ rẹ pẹlu iparun cytoskeleton.
Igara MK493-CF1 ti ya sọtọ si ile ni Shinagawa-ku, Tokyo.Igara MK493-CF1 akoso daradara-branched stromal mycelium.Ilana apa kan ti jiini RNA ribosomal 16S (1422 bp) ti pinnu.Iyara yii jọra pupọ si S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: igara aṣoju, 99.93%).Da lori abajade yii, a pinnu pe igara yii ni ibatan pẹkipẹki si iru igara S. werraensis.Nítorí náà, a provisionally ti a npè ni yi igara S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T tun ṣe agbejade awọn agbo ogun bioactive kanna.Niwọn igba ti iwadii kutukutu kekere wa lati gba awọn ọja adayeba lati inu microorganism yii, a ṣe iwadii kemikali siwaju sii.Lẹhin ogbin ti S. werraensis MK493-CF1 lori alabọde barle nipasẹ bakteria-ipinle ti o lagbara ni 30 ° C fun awọn ọjọ 14, alabọde ti fa jade pẹlu 50% EtOH.60 milimita ti ayẹwo ti gbẹ lati gba 59.5 miligiramu ti jade robi.Awọn jade robi ti a tunmọ si yiyipada alakoso HPLC lati fun N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ti a npè ni coumamonamide, 36.0 mg).Apapọ iye ti 1 jẹ isunmọ 60% ti jade robi.Nitorinaa, a pinnu lati ṣe iwadi ni awọn alaye awọn ohun-ini ti kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 jẹ lulú amorphous funfun kan ati iwọn spectrometry giga giga (HRESIM) jẹrisi C6H8N2O2 (Fig. 1).Ajẹkù pyrrole ti o rọpo C2 ti agbo-ara yii jẹ ifihan nipasẹ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ni 1H NMR spectrum: 4.5 Hz) , H-5) ati δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ati awọn 13C NMR julọ.Oniranran fihan niwaju mẹrin awọn ọta carbon sp2.Iwaju ẹgbẹ amide kan ni ipo C2 ni a ṣe ayẹwo nipasẹ ibamu HMBC lati proton C-3 si erogba carbonyl amide ni δC 161.1.Ni afikun, 1 H ati 13 C NMR ti o ga julọ ni δH 4.10 (3H, S) ati δC 68.3 tọkasi wiwa awọn ẹgbẹ N-methoxy ninu moleku.Botilẹjẹpe ipo ti o pe ti ẹgbẹ methoxy ko tii pinnu ni lilo itupalẹ spectroscopic gẹgẹbi imudara spectroscopy iyato ati iparun Overhauser abbreviation (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide di agbo oludije akọkọ.
Lati pinnu eto ti o tọ ti 1, a ṣe akojọpọ apapọ lapapọ (Fig. 2a).Itoju ti 2-aminopyridine 2 ti o wa ni iṣowo pẹlu m-CPBA yorisi N-oxide 3 ti o baamu ni ikore titobi.Lẹhin 2-aminoazidation ti 2, iṣesi cyclocondensation ti Abramovich ṣe apejuwe ni a ṣe ni benzene ni 90 ° C lati gba 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ti o fẹ ni giramu.Iyara 60% (awọn ipele meji).15,16.Methylation ati hydrolysis ti 4 lẹhinna fun 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (ti a npe ni "cumotonic acid", 6) ni ikore ti o dara (70%, awọn igbesẹ meji).Nikẹhin, amidation nipasẹ acid chloride intermediate 6 nipa lilo amonia olomi fun Kumamoto amide 1 ni 98% ikore.Gbogbo awọn alaye iwoye ti iṣelọpọ 1 jẹ iru si 1 ti o ya sọtọ, nitorinaa ilana ti 1 ti pinnu;
Isọpọ gbogbogbo ati itupalẹ iṣẹ ṣiṣe ti ibi ti urbenamide ati urbenic acid.(a) Lapapọ idapọ ti Kumamoto amide.(b) Irugbin Arabidopsis Columbia (Col) ti o jẹ ọjọ meje ti o dagba ni a dagba lori awọn awo Murashige ati Skoog (MS) ti o ni coumamonamide 6 tabi coumamonamide 1 ni awọn ifọkansi itọkasi.Pẹpẹ iwọn = 1 cm.
Ni akọkọ, a ṣe ayẹwo awọn iṣẹ iṣe ti urbenamide ati awọn agbedemeji rẹ fun agbara wọn lati ṣe iyipada idagbasoke ọgbin.A ṣafikun ọpọlọpọ awọn ifọkansi ti ursmonamide 1 tabi ursmonic acid 6 si MS agar alabọde ati gbin Arabidopsis thaliana seedlings lori alabọde yii.Awọn igbelewọn wọnyi fihan pe awọn ifọkansi giga (500 μM) ti 6 idilọwọ idagbasoke root (Fig. 2b).Nigbamii ti, a ṣe ipilẹṣẹ ọpọlọpọ awọn itọsẹ nipa fifidipo ipo N1 ti 6 ati ṣiṣe eto-iṣiro ibatan iṣẹ-ṣiṣe lori wọn (ilana isọdọkan afọwọṣe jẹ apejuwe ninu Alaye Atilẹyin (SI)).Awọn irugbin Arabidopsis ti dagba lori alabọde kan ti o ni awọn itọsẹ ursonic acid 50 μM, ati pe gigun gbongbo ni a wọn.bi o ti han lori aworan.Gẹgẹbi a ṣe han ni Awọn nọmba 3a, b, ati S1, awọn coumamo acids ni awọn gigun oriṣiriṣi ti awọn ẹwọn alkoxy laini (9, 10, 11, 12, ati 13) tabi awọn ẹwọn alkoxy nla (15, 16, ati 17) ni ipo N1.Awọn itọsẹ ṣe afihan idinamọ pataki ti idagbasoke gbongbo.Ni afikun, a ri pe ohun elo ti 200 μM 10, 11, tabi 17 idinamọ germination (Figs. 3c ati S2).
Iwadi ti ibatan-iṣẹ-ṣiṣe ti Kumamoto amide ati awọn agbo ogun ti o jọmọ.(a) Iṣeto ati ilana iṣelọpọ ti awọn analogues.(b) Isọdiwọn gigun ti gbongbo ti awọn irugbin ọjọ-ọjọ 7 ti o dagba lori alabọde MS pẹlu tabi laisi 50 μM awọn itọsẹ coumamonamide.Asterisks tọkasi awọn iyatọ pataki pẹlu itọju sham (t idanwo, p<0.05).n >18. Data ti wa ni han bi tumosi ± SD.nt tumọ si “ko ṣe idanwo” nitori diẹ sii ju 50% awọn irugbin ko dagba.(c) Isọdiwọn oṣuwọn germination ti awọn irugbin ti a ṣe itọju ti a fi silẹ fun awọn ọjọ 7 ni alabọde MS pẹlu tabi laisi 200 μM coumamonamide ati awọn agbo ogun ti o jọmọ.Asterisks ṣe afihan awọn iyatọ pataki pẹlu itọju sham (idanwo chi-square).n=96.
O yanilenu, afikun ti awọn ẹwọn ẹgbẹ alkyl to gun ju C9 dinku iṣẹ-ṣiṣe inhibitory, ni iyanju pe awọn agbo ogun ti o ni ibatan acid kumamotoic nilo awọn ẹwọn ẹgbẹ ti iwọn kan lati ṣafihan iṣẹ ṣiṣe ti ibi wọn.
Nitoripe igbekale ibatan iṣẹ ṣiṣe fihan pe C9 ti yipada si ursonic acid ati itọsẹ nonyloxy ti ursonic acid (lẹhin ti a tọka si KAND 11) jẹ oludena idagbasoke ọgbin ti o munadoko julọ, a ṣe apejuwe alaye diẹ sii ti KAND 11. Itoju ti Arabidopsis pẹlu 50 μM KAND 11 ti o fẹrẹ dena germination patapata, lakoko ti awọn ifọkansi kekere (40, 30, 20, tabi 10 μM) ti KAND 11 ṣe idiwọ idagbasoke gbongbo ni ọna ti o gbẹkẹle iwọn lilo (Fig. 4a, b).Lati ṣe idanwo boya KAND 11 yoo ni ipa lori ṣiṣeeṣe meristem root, a ṣe ayẹwo awọn meristems root ti o ni abawọn pẹlu propidium iodide (PI) ati iwọn iwọn agbegbe meristem.Iwọn ti meristem ti awọn irugbin ti o dagba lori alabọde ti o ni 25 μM KAND-11 jẹ 151.1 ± 32.5 μm, lakoko ti iwọn awọn meristem ti awọn irugbin ti o dagba lori alabọde iṣakoso ti o ni DMSO jẹ 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , eyi ti o tọkasi pe KAND-11 ṣe atunṣe iṣẹ-ṣiṣe cellular.itankale.Gbongbo Meristem.Ni ibamu pẹlu eyi, KAND 11 itọju dinku iye ti ami pipin sẹẹli CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS ifihan agbara ni root meristem (Fig. 4e) 17.Awọn abajade wọnyi fihan pe KAND 11 ṣe idiwọ idagbasoke gbongbo nipasẹ didin iṣẹ iṣelọpọ sẹẹli.
Onínọmbà ipa idilọwọ ti awọn itọsẹ urbenonic acid (awọn itọsẹ urbenyloxy) lori idagbasoke.(a) Awọn irugbin Col-iru egan ọjọ 7 ti o dagba lori awọn awo MS pẹlu awọn ifọkansi itọkasi ti KAND 11. Pẹpẹ iwọn = 1 cm.(b) Quantification ti root ipari.Awọn lẹta tọkasi awọn iyatọ nla (idanwo Tukey HSD, p<0.05).n >16. Data ti wa ni han bi tumosi ± SD.(c) Confocal microscopy of propidium iodide-abariwon iru egan Col roots dagba lori MS farahan pẹlu tabi laisi 25 μM KAND 11. White biraketi tọkasi root meristem.Pẹpẹ iwọn = 100 µm.(d) Isọdiwọn iwọn meristem root (n = 10 si 11).Awọn iyatọ iṣiro ti pinnu nipa lilo t-idanwo (p<0.05).Awọn ifi duro fun iwọn meristem apapọ.(e) Iyatọ kikọlu iyatọ (DIC) maikirosikopu ti root meristem ti o ni itumọ CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS ni abawọn ati abariwon lori awọn irugbin ọjọ-5-ọjọ ti o dagba lori awọn awo MS pẹlu tabi laisi 25 µM KAND assay.
Awọn phytotoxicity ti KAND 11 ti ni idanwo siwaju sii nipa lilo ohun ọgbin dicotyledonous miiran, taba (Nicotiana tabacum), ati ẹya-ara awoṣe ọgbin ọgbin pataki kan, liverwort (Marchantia polymorpha).Gẹgẹbi ọran Arabidopsis, taba SR-1 awọn irugbin ti o dagba lori alabọde ti o ni 25 μM KAND 11 ti o ṣe awọn gbongbo kukuru (Fig. 5a).Ni afikun, 40 ti awọn irugbin 48 ti o dagba lori awọn awo ti o ni 200 μM KAND 11, lakoko ti gbogbo awọn irugbin 48 ti dagba lori awọn media ti a tọju ẹgan, ti o nfihan pe awọn ifọkansi giga ti KAND ṣe pataki (p).<0.05;chi igbeyewo -square) idinamọ awọn germination ti taba.(Eya. 5b).Ni afikun, ifọkansi ti KAND 11 ti o dẹkun idagbasoke kokoro-arun ni liverwort jẹ iru ifọkansi ti o munadoko ni Arabidopsis (Fig. 5c).Awọn abajade wọnyi fihan pe KAND 11 le ṣe idiwọ idagbasoke ti awọn oriṣiriṣi awọn irugbin.Lẹhinna a ṣe iwadii cytotoxicity ti o ṣeeṣe ti awọn agbo ogun ti o ni ibatan monoamide ninu awọn oganisimu miiran, eyun awọn sẹẹli HeLa eniyan ati igara Escherichia coli DH5a, gẹgẹbi awọn aṣoju ti ẹranko ti o ga julọ ati awọn sẹẹli kokoro-arun, lẹsẹsẹ.Ninu awọn iṣiro ti iṣelọpọ sẹẹli, a ṣe akiyesi pe coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, ati KAND 11 ko ni ipa lori idagbasoke ti awọn sẹẹli HeLa tabi E. coli ni awọn ifọkansi ti 100 μM (Fig. 5d,e).
Idilọwọ idagbasoke ti KAND 11 ninu awọn ohun alumọni ti kii ṣe Arabidopsis.(a) Irugbin taba tobako SR-1-ọsẹ meji ni a gbin lori awọn apẹrẹ MS ti o wa ni inaro ti o ni 25 μM KAND 11. (b) Irugbin taba ti o ni ọsẹ meji SR-1 ni a gbin lori ipo ti o wa ni ita gbangba. Awọn awo MS ti o ni 200 μM KAND 11. (c) Iru-ẹgan-iru-ẹgan-ọsẹ meji-meji Tak-1 liverwort buds ti o dagba lori awọn apẹrẹ Gamborg B5 pẹlu awọn ifọkansi itọkasi ti KAND 11. Awọn itọka pupa ṣe afihan awọn spores ti o dẹkun dagba laarin isọdọtun ọsẹ meji. akoko.(d) Ayẹwo imudara sẹẹli ti awọn sẹẹli HeLa.Nọmba awọn sẹẹli ti o le yanju ni a wọn ni awọn aaye arin ti o wa titi nipa lilo ohun elo kika sẹẹli 8 (Dojindo).Gẹgẹbi iṣakoso, awọn sẹẹli HeLa ṣe itọju pẹlu 5 μg/ml actinomycin D (Ofin D), eyiti o ṣe idiwọ transcription RNA polymerase ati fa iku sẹẹli.Awọn itupalẹ ni a ṣe ni ilọpo mẹta.(e) E. coli cell proliferation assay.E. coli idagbasoke ti a atupale nipa idiwon OD600.Gẹgẹbi iṣakoso, a ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu 50 μg/ml ampicillin (Amp), eyiti o ṣe idiwọ iṣelọpọ ogiri sẹẹli.Awọn itupalẹ ni a ṣe ni ilọpo mẹta.
Lati pinnu ilana iṣe ti cytotoxicity ti o ṣẹlẹ nipasẹ awọn agbo ogun ti o ni ibatan uramide, a tun ṣe itupalẹ awọn itọsẹ urbenic acid pẹlu awọn ipa inhibitory iwọntunwọnsi.bi o ti han lori aworan.Gẹgẹbi a ṣe han ni Awọn nọmba 2b, 6a, awọn irugbin ti o dagba lori awọn agar agar ti o ni awọn ifọkansi giga (200 μM) ti urmotonic acid 6 ṣe agbejade awọn gbongbo kukuru ati ti osi (θ = - 23.7 ± 6.1), lakoko ti awọn irugbin ti o dagba lori alabọde iṣakoso, awọn awọn irugbin ti o fẹrẹ ṣe awọn gbongbo ti o taara (θ = – 3.8 ± 7.1).Idagba oblique abuda yii jẹ eyiti a mọ lati abajade lati ailagbara ti awọn microtubules cortical14,18.Ni ibamu pẹlu wiwa yii, awọn oogun disopyramide-destabilizing microtubule ati oryzalin ṣe idawọle iru root tilting labẹ awọn ipo idagbasoke wa (Figs. 2b, 6a).Ni akoko kanna, a ṣe idanwo awọn itọsẹ urmotonic acid ati yan ọpọlọpọ ninu wọn ti, ni awọn ifọkansi kan, ti o fa idagbasoke gbongbo oblique.Awọn akojọpọ 8, 9, ati 15 yipada itọsọna ti idagbasoke gbongbo ni 75 μM, 50 μM, ati 40 μM, ni atẹlera, ti o nfihan pe awọn agbo ogun wọnyi le ṣe imunadoko awọn microtubules (Fig. 2b, 6a).A tun ṣe idanwo itọsẹ ursolic acid ti o lagbara julọ, KAND 11, ni ifọkansi kekere (15 µM) ati rii pe ohun elo ti KAND 11 ṣe idiwọ idagbasoke gbongbo ati pe itọsọna ti idagbasoke gbongbo ko ni aiṣedeede, botilẹjẹpe wọn nifẹ lati lọ si apa osi ( olusin C3)..Nitori awọn ifọkansi ti o ga julọ ti microtubule-destabilizing awọn oogun nigbakan ṣe idiwọ idagbasoke ọgbin kuku ju fa tilting root, a ṣe ayẹwo atẹle naa o ṣeeṣe pe KAND 11 yoo ni ipa lori awọn microtubules nipa wiwo awọn microtubules cortical ni awọn sẹẹli epidermal root.Immunohistochemistry nipa lilo awọn egboogi-β-tubulin antibodies ninu awọn sẹẹli epidermal ti awọn gbongbo irugbin ti a tọju pẹlu 25 μM KAND 11 ṣe afihan isonu ti fere gbogbo awọn microtubules cortical ni awọn sẹẹli epidermal ni agbegbe elongation (Fig. 6b).Awọn abajade wọnyi fihan pe kumamotonic acid ati awọn itọsẹ rẹ n ṣiṣẹ taara tabi ni aiṣe-taara lori awọn microtubules lati dabaru ati pe awọn agbo ogun wọnyi jẹ awọn inhibitors microtubule aramada.
Ursonic acid ati awọn itọsẹ rẹ paarọ awọn microtubules cortical ni Arabidopsis thaliana.(a) Igun ti idagẹrẹ ti gbongbo ti a ṣe iwọn niwaju ọpọlọpọ awọn itọsẹ urmotonic acid ni awọn ifọkansi itọkasi.Awọn ipa ti awọn agbo ogun meji ti a mọ lati dẹkun awọn microtubules: disopyramide ati oryzalin ni a tun ṣe ayẹwo.Inset fihan boṣewa ti a lo lati wiwọn igun idagbasoke gbongbo.Asterisks tọkasi awọn iyatọ pataki pẹlu itọju sham (t idanwo, p<0.05).n >19. Opa asekale = 1 cm.(b) Awọn microtubules Cortical ninu awọn sẹẹli epidermal ni agbegbe elongation.Microtubules ni iru-ara Arabidopsis Col roots ti o dagba lori awọn awo MS pẹlu tabi laisi 25 μM KAND 11 ni a fi oju han nipasẹ abawọn immunohistochemical nipa lilo awọn egboogi akọkọ β-tubulin ati Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies.Pẹpẹ iwọn = 10 µm.(c) Mitotic be ti microtubules ninu root meristem.Awọn microtubules ni a fi oju han nipa lilo idoti ajẹsara.Awọn ẹya mitotic, pẹlu awọn agbegbe prophase, spindles, ati phragmoplasts, ni a kà lati awọn aworan confocal.Awọn itọka tọkasi awọn ẹya microtubule mitotic.Asterisks tọkasi awọn iyatọ pataki pẹlu itọju sham (t idanwo, p<0.05).n >9. Pẹpẹ iwọn = 50 µm.
Botilẹjẹpe Ursa ni agbara lati ṣe idalọwọduro iṣẹ microtubule, ilana iṣe rẹ ni a nireti lati yatọ si awọn aṣoju depolymerizing microtubule aṣoju.Fun apẹẹrẹ, awọn ifọkansi giga ti microtubule depolymerizing awọn aṣoju bii disopyramide ati oryzalin fa imugboroja anisotropic ti awọn sẹẹli epidermal, lakoko ti KAND 11 ko ṣe.Ni afikun, ohun elo ti KAND 11 ati disopyramide jẹ abajade idagbasoke idagbasoke root ti o ni idapọ-disopyramide ati KAND 11 ti o ni idinamọ idagbasoke ti a ṣe akiyesi (Fig. S4).A tun ṣe atupale idahun ti hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant si KAND 11. phs1-1 ni iyipada aaye tubulin kinase ti kii-canonical ati ki o ṣe awọn gbongbo kukuru nigba itọju pẹlu disopyramide9,20.phs1-1 awọn irugbin mutant ti o dagba lori alabọde agar ti o ni KAND 11 ni awọn gbongbo kukuru ti o jọra si awọn ti o dagba lori dispyramid (fig. S5).
Ni afikun, a ṣe akiyesi awọn ẹya microtubule mitotic, gẹgẹbi awọn agbegbe prophase, spindles, ati phragmoplasts, ninu root meristem ti awọn irugbin ti a tọju pẹlu KAND 11. Ni ibamu pẹlu awọn akiyesi fun CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, idinku nla ninu nọmba awọn microtubules mitotic ni a ṣe akiyesi (Fig. .6c).
Lati ṣe apejuwe cytotoxicity ti KAND 11 ni ipinnu subcellular, a tọju taba BY-2 awọn sẹẹli idadoro pẹlu KAND 11 ati ṣe akiyesi esi wọn.A kọkọ ṣafikun KAND 11 si awọn sẹẹli BY-2 ti n ṣalaye TagRFP-TUA6, eyiti o fi aami si awọn microtubules fluorescently, lati ṣe ayẹwo ipa ti KAND 11 lori awọn microtubules cortical.Iwọnwọn microtubule cortical ni a ṣe ayẹwo nipa lilo itupalẹ aworan, eyiti o ṣe iwọn ipin ogorun awọn piksẹli cytoskeletal laarin awọn piksẹli cytoplasmic.Awọn abajade idanwo fihan pe lẹhin itọju pẹlu 50 μM tabi 100 μM KAND 11 fun wakati 1, iwuwo dinku ni pataki si 0.94 ± 0.74% tabi 0.23 ± 0.28%, lẹsẹsẹ, lakoko ti iwuwo awọn sẹẹli ti a tọju pẹlu DMSO, jẹ 1.634 ± % (aworan. 7a).Awọn abajade wọnyi wa ni ibamu pẹlu akiyesi ni Arabidopsis pe KAND 11 itọju nfa idasile ti awọn microtubules cortical (Fig. 6b).A tun ṣe ayẹwo laini BY-2 pẹlu GFP-ABD-aami actin filaments lẹhin itọju pẹlu ifọkansi kanna ti KAND 11 ati ki o ṣe akiyesi pe KAND 11 itọju ṣe idilọwọ awọn filaments actin.Itoju pẹlu 50 μM tabi 100 μM KAND 11 fun 1 h dinku iwuwo actin filament pataki si 1.20 ± 0.62% tabi 0.61 ± 0.26%, ni atele, lakoko ti iwuwo ninu awọn sẹẹli ti a tọju DMSO jẹ 1.69 ± 0.51% (Fig 1.69 ± 0.51%).7b).Awọn abajade wọnyi ṣe iyatọ si awọn ipa ti propyzamide, eyiti ko ni ipa awọn filaments actin, ati latrunculin B, actin depolymerizer ti ko ni ipa lori awọn microtubules (SI Figure S6).Ni afikun, itọju pẹlu coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, tabi KAND 11 ko ni ipa lori awọn microtubules ninu awọn sẹẹli HeLa (SI Figure S7).Nitorinaa, ilana iṣe ti KAND 11 ni a gbagbọ pe o yatọ si ti awọn idalọwọduro cytoskeleton ti a mọ.Ni afikun, akiyesi microscopic wa ti awọn sẹẹli BY-2 ti a tọju pẹlu KAND 11 ṣafihan ibẹrẹ ti iku sẹẹli lakoko itọju KAND 11 ati fihan pe ipin ti awọn sẹẹli ti o ku buluu Evans ko pọ si ni pataki lẹhin 30 min ti itọju KAND 11, botilẹjẹpe lẹhin awọn iṣẹju 90 ti itọju pẹlu 50 μM tabi 100 μM KAND, nọmba awọn sẹẹli ti o ku pọ si 43.7% tabi 80.1%, lẹsẹsẹ (Fig. 7c).Papọ, awọn data wọnyi tọka pe aramada ursolic acid itọsẹ KAND 11 jẹ inhibitor cytoskeletal kan pato ọgbin pẹlu ilana iṣe aimọ tẹlẹ.
KAND ni ipa lori awọn microtubules cortical, actin filaments, ati ṣiṣeeṣe ti awọn sẹẹli taba BY-2.(a) Wiwo ti awọn microtubules cortical ni awọn sẹẹli BY-2 ni iwaju TagRFP-TUA6.Awọn sẹẹli BY-2 ti a tọju pẹlu KAND 11 (50 μM tabi 100 μM) tabi DMSO ni a ṣe ayẹwo nipasẹ ohun airi confocal.Iwọnwọn microtubule Cortical jẹ iṣiro lati awọn micrographs ti awọn sẹẹli olominira 25.Awọn lẹta tọkasi awọn iyatọ nla (idanwo Tukey HSD, p<0.05).Pẹpẹ iwọn = 10 µm.(b) Awọn filaments actin cortical ninu awọn sẹẹli BY-2 ti a ṣe ojuran ni iwaju GFP-ABD2.Awọn sẹẹli BY-2 ti a tọju pẹlu KAND 11 (50 μM tabi 100 μM) tabi DMSO ni a ṣe ayẹwo nipasẹ ohun airi confocal.Awọn iwuwo ti awọn filaments actin cortical jẹ iṣiro lati awọn micrographs ti awọn sẹẹli olominira 25.Awọn lẹta tọkasi awọn iyatọ nla (idanwo Tukey HSD, p<0.05).Pẹpẹ iwọn = 10 µm.(c) Akiyesi ti awọn sẹẹli BY-2 ti o ku nipasẹ abawọn buluu Evans.Awọn sẹẹli BY-2 ti a tọju pẹlu KAND 11 (50 μM tabi 100 μM) tabi DMSO ni a ṣe ayẹwo nipasẹ airi aaye-imọlẹ.n=3.Pẹpẹ iwọn = 100 µm.
Awari ati ohun elo ti awọn ọja adayeba titun ti yori si awọn ilọsiwaju pataki ni ọpọlọpọ awọn aaye ti igbesi aye eniyan, pẹlu oogun ati iṣẹ-ogbin.A ti ṣe iwadii itan-akọọlẹ lati gba awọn agbo ogun ti o wulo lati awọn orisun adayeba.Ni pataki, actinomycetes ni a mọ pe o wulo bi awọn aporo antiparasitic fun nematodes nitori agbara wọn lati ṣe agbejade ọpọlọpọ awọn metabolites Atẹle bii avermectin, apopọ asiwaju ti ivermectin ati bleomycin ati awọn itọsẹ rẹ, ti a lo ni oogun bi aṣoju anticancer21,22.Bakanna, ọpọlọpọ awọn agbo ogun herbicidal ni a ti ṣe awari lati actinomycetes, diẹ ninu eyiti a ti lo tẹlẹ ni iṣowo1,23.Nitorinaa, itupalẹ ti awọn metabolites actinomycete lati ya sọtọ awọn ọja adayeba pẹlu awọn iṣẹ ṣiṣe ti ibi ti o fẹ ni a gba imọran ti o munadoko.Ninu iwadi yii, a ṣe awari agbo-ara tuntun kan, coumamonamide, lati S. werraensis ati ni aṣeyọri ti iṣelọpọ.Ursonic acid jẹ agbedemeji sintetiki ti urbenamide ati awọn itọsẹ rẹ.O le fa curling root ti iwa, ṣe afihan iwọntunwọnsi si iṣẹ ṣiṣe herbicidal ti o lagbara, ati taara tabi ni aiṣe-taara ba awọn microtubules ọgbin jẹ.Sibẹsibẹ, ilana iṣe ti urmotonic acid le yato si ti awọn inhibitors microtubule ti o wa tẹlẹ, nitori KAND 11 tun fa awọn filament actin ati fa iku sẹẹli, ni iyanju ilana ilana nipasẹ eyiti urmotonic acid ati awọn itọsẹ rẹ ni ipa lori ọpọlọpọ awọn ẹya cytoskeletal..
Isọdi alaye siwaju sii ti urbenonic acid yoo ṣe iranlọwọ lati ni oye daradara si ẹrọ iṣe ti urbenonic acid.Ni pataki, ibi-afẹde ti o tẹle ni lati ṣe iṣiro agbara ursonic acid lati sopọ si awọn microtubules ti o dinku lati pinnu boya ursonic acid ati awọn itọsẹ rẹ ṣiṣẹ taara lori awọn microtubules ati depolymerize wọn, tabi boya awọn iṣe wọn ni abajade ni idamu microtubule.Ni afikun, ninu ọran nibiti awọn microtubules kii ṣe ibi-afẹde taara, idamọ aaye ti iṣe ati awọn ibi-afẹde molikula ti ursonic acid lori awọn sẹẹli ọgbin yoo ṣe iranlọwọ siwaju ni oye awọn ohun-ini ti awọn agbo ogun ti o ni ibatan ati awọn ọna ti o ṣeeṣe lati mu iṣẹ ṣiṣe herbicidal dara si.Iwadii bioactivity wa ṣe afihan agbara cytotoxic alailẹgbẹ ti ursonic acid lori idagba awọn irugbin bii Arabidopsis thaliana, taba ati liverwort, lakoko ti ko kan E. coli tabi awọn sẹẹli HeLa.Kekere tabi rara majele si awọn sẹẹli ẹranko jẹ anfani ti awọn itọsẹ ursonic acid ti wọn ba ni idagbasoke bi awọn herbicides fun lilo ni awọn aaye ogbin ṣiṣi.Nitootọ, niwọn bi awọn microtubules jẹ awọn ẹya ti o wọpọ ni awọn eukaryotes, idinamọ yiyan wọn ninu awọn irugbin jẹ ibeere pataki fun awọn herbicides.Fun apẹẹrẹ, propyzamide, oluranlowo depolymerizing microtubule ti o sopọ taara si tubulin ati idilọwọ polymerization, ni a lo bi oogun egboigi nitori majele kekere rẹ si awọn sẹẹli ẹranko24.Ni idakeji si disopyramide, awọn benzamides ti o ni ibatan ni awọn pato ibi-afẹde oriṣiriṣi.Ni afikun si awọn microtubules ọgbin, RH-4032 tabi benzoxamide tun ṣe idiwọ awọn microtubules ti awọn sẹẹli ẹranko tabi oomycetes, lẹsẹsẹ, ati zalilamide ni a lo bi fungicide nitori kekere phytotoxicity25,26,27.Beari tuntun ti a ṣe awari ati awọn itọsẹ rẹ ṣe afihan cytotoxicity yiyan lodi si awọn irugbin, ṣugbọn o tọ lati ṣe akiyesi pe awọn iyipada siwaju le paarọ pato ibi-afẹde wọn, ni agbara pese awọn itọsẹ afikun fun iṣakoso awọn elu pathogenic tabi oomycetes.
Awọn ohun-ini alailẹgbẹ ti urbenonic acid ati awọn itọsẹ rẹ wulo fun idagbasoke wọn bi awọn herbicides ati lilo bi awọn irinṣẹ iwadii.Pataki ti cytoskeleton ni ṣiṣakoso apẹrẹ sẹẹli ọgbin jẹ olokiki pupọ.Awọn ijinlẹ iṣaaju ti fihan pe awọn ohun ọgbin ti ṣe agbekalẹ awọn ilana idiju ti agbari microtubule cortical nipasẹ ṣiṣakoso awọn agbara microtubule lati ṣakoso morphogenesis daradara.Nọmba nla ti awọn ohun elo ti o ni iduro fun ilana ti iṣẹ ṣiṣe microtubule ni a ti ṣe idanimọ, ati pe iwadii ti o jọmọ ṣi nlọ lọwọ3,4,28.Oye wa lọwọlọwọ ti awọn iyipada microtubule ninu awọn sẹẹli ọgbin ko ṣe alaye ni kikun awọn ilana ti agbari microtubule cortical.Fun apẹẹrẹ, botilẹjẹpe mejeeji disopyramide ati oryzalin le depolymerize awọn microtubules, disopyramide fa idarudapọ root nla lakoko ti oryzalin ni ipa kekere kan.Pẹlupẹlu, awọn iyipada ninu tubulin, eyiti o ṣeduro awọn microtubules, tun fa dextrorotation ninu awọn gbongbo, lakoko ti paclitaxel, eyiti o tun ṣe iduro awọn agbara microtubule, ko ṣe.Nitorinaa, ikẹkọ ati idamọ awọn ibi-afẹde molikula ti ursolic acid yẹ ki o pese awọn oye tuntun si ilana ti awọn microtubules cortical ọgbin.Bakanna, awọn afiwera ọjọ iwaju ti awọn kemikali ti o munadoko ninu igbega idagbasoke ti o daru, gẹgẹbi disopyramide, ati awọn kẹmika ti ko munadoko, bii oryzalin tabi kumamotoric acid, yoo pese awọn amọran si bi idagbasoke ti o daru ṣe waye.
Ni apa keji, awọn atunto cytoskeletal ti o ni ibatan aabo jẹ iṣeeṣe miiran lati ṣe alaye cytotoxicity ti ursonic acid.Ikolu ti pathogen tabi ifihan ti elicitor sinu awọn sẹẹli ọgbin nigbakan fa iparun ti cytoskeleton ati iku sẹẹli ti o tẹle29.Fun apẹẹrẹ, oomycete-ti ari cryptoxanthin ti royin lati da awọn microtubules ati awọn filaments actin silẹ ṣaaju iku sẹẹli taba, iru si ohun ti o waye pẹlu itọju KAND30,31.Awọn ibajọra laarin awọn idahun idaabobo ati awọn idahun cellular ti o fa nipasẹ ursonic acid mu wa lati ṣe akiyesi pe wọn nfa awọn ilana cellular ti o wọpọ, botilẹjẹpe ipa iyara ati okun sii ti ursonic acid ju cryptoxanthin jẹ gbangba.Bibẹẹkọ, awọn ijinlẹ ti fihan pe idalọwọduro ti awọn filaments actin ṣe igbega iku sẹẹli lẹẹkọkan, eyiti kii ṣe nigbagbogbo pẹlu idalọwọduro microtubule29.Ni afikun, o wa lati rii boya boya pathogen tabi elicitor nfa idagbasoke ti gbongbo daru, gẹgẹbi awọn itọsẹ ursonic acid ṣe.Nitorinaa, imọ molikula ti o so awọn idahun aabo ati cytoskeleton jẹ iṣoro ti o wuyi lati koju.Nipa ilokulo wiwa awọn agbo ogun iwuwo molikula kekere ti o ni ibatan si ursonic acid, bakanna bi ọpọlọpọ awọn itọsẹ pẹlu awọn agbara oriṣiriṣi, wọn le pese awọn aye lati fojusi awọn ilana cellular ti a ko mọ.
Ti a mu papọ, wiwa ati ohun elo ti awọn agbo ogun tuntun ti o ṣe iyipada awọn adaṣe microtubule yoo pese awọn ọna ti o lagbara lati koju awọn ilana molikula eka ti o wa labẹ ipinnu apẹrẹ sẹẹli ọgbin.Ni aaye yii, urmotonic acid ti o ni idagbasoke laipe, eyiti o ni ipa lori awọn microtubules ati awọn filaments actin ati ki o fa iku iku sẹẹli, le pese anfani lati ṣawari asopọ laarin iṣakoso microtubule ati awọn ilana miiran.Nitorinaa, itupalẹ kemikali ati ti ẹkọ nipa lilo urbenonic acid yoo ṣe iranlọwọ fun wa lati loye awọn ilana ilana molikula ti o ṣakoso cytoskeleton ọgbin.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 sinu 500 milimita baffled Erlenmeyer flask ti o ni 110 milimita ti alabọde irugbin ti o wa ninu 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w / v) agbado jade (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 ati 0.2% CaCO3 ni omi deionized.(pH 7.4 ṣaaju sterilization).Awọn aṣa irugbin ti wa ni idawọle lori gbigbọn iyipo (180 rpm) ni 27 ° C fun awọn ọjọ 2.Ogbin iṣelọpọ nipasẹ bakteria ipinle to lagbara.Aṣa irugbin (7 milimita) ni a gbe sinu 500 milimita K-1 filasi ti o ni 40 g ti alabọde iṣelọpọ ti o wa ninu 15 g ti barle ti a tẹ (MUSO Co., Ltd., Japan) ati 25 g ti omi deionized (pH ko tunṣe ṣaaju ki sterilization).).Bakteria ti gbe jade ni 30 ° C ninu okunkun fun awọn ọjọ 14.Awọn ohun elo bakteria ti jade pẹlu 40 milimita / igo EtOH ati centrifuged (1500 g, 4°C, 10 min).Olori-ara aṣa (60 milimita) ni a fa jade pẹlu adalu 10% MeOH/EtOAc.Layer Organic ti yọ kuro labẹ titẹ idinku lati gba iyoku (59.5 miligiramu), eyiti a tẹriba si HPLC pẹlu elution gradient (0-10 iṣẹju: 90%) lori iwe alakoso yiyipada (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × ipari 250 mm) H2O/CH3CN, iṣẹju 10–35: 90% H2O/CH3CN si 70% H2O/CH3CN (gradient), iṣẹju 35–45: 90% H2O/EtOH, 45–155 iṣẹju: 90% H2O / EtOH si 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) ni iwọn sisan ti 1.5 milimita / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) ti ya sọtọ bi erupẹ amorphous funfun.
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1,8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3,8 Hz, 1H).), 4.08 (awọn, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ iye iṣiro: 141.0659, iye iwọn: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 153 cm
Awọn irugbin Columbia (Col-0) ni a gba lati Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) pẹlu igbanilaaye fun lilo iwadii.Awọn irugbin Col-0 ni a tan kaakiri ati ṣetọju labẹ awọn ipo ile-iyẹwu wa ati lo bi awọn irugbin Arabidopsis iru-igbẹ.Awọn irugbin Arabidopsis jẹ sterilized dada ati gbin ni idaji-agbara Murashige ati alabọde Skoog ti o ni 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Kemikali), 0.05% (w/v) 2- (4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Kemikali Pure). ).) ati 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ni 23 °C ati ina nigbagbogbo.Awọn irugbin ti mutanti phs1-1 ni a pese nipasẹ T. Hashimoto (Ile-ẹkọ Imọ-jinlẹ ti Nara ati Imọ-ẹrọ).
Awọn irugbin ti igara SR-1 ni a pese nipasẹ T. Hashimoto (Ile-iṣẹ Imọ-ẹrọ ati Imọ-ẹrọ Nara) ati lo bi awọn irugbin taba iru egan.Awọn irugbin taba jẹ sterilized dada ati fi sinu omi ti ko ni ito fun oru mẹta lati ṣe igbega germination, lẹhinna gbe sinu ojutu agbara idaji kan ti o ni 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, ati 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murshige.ati Skoog alabọde) pẹlu pH 5.7 ati pe o wa ni 23°C labẹ ina igbagbogbo.
Strain Tak-1 ni a pese nipasẹ T. Kohchi (Ile-ẹkọ giga Kyoto) ati pe a lo bi ẹyọkan idanwo boṣewa fun iwadii ẹdọ.A gba Gemma lati awọn ohun ọgbin gbin sterilized ati lẹhinna palara lori alabọde Gamborg B5 (Fujifilm Wako Kemikali Pure) ti o ni 1% sucrose ati 0.3% gellan gomu ati ti a fi sii ni 23°C labẹ ina lilọsiwaju.
Taba BY-2 ẹyin (Nicotiana tabacum L. cv. Imọlẹ Yellow 2) ti pese nipasẹ S. Hasezawa (University of Tokyo).Awọn sẹẹli BY-2 ti fomi 95-agbo ni Linsmeier ti a ṣe atunṣe ati alabọde Skoog ati afikun ni ọsẹ pẹlu 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32.Idaduro sẹẹli ti dapọ lori gbigbọn iyipo ni 130 rpm ni 27°C ninu okunkun.Fọ awọn sẹẹli pẹlu awọn akoko 10 iwọn iwọn ti alabọde tuntun ati tun pada ni alabọde kanna.BY-2 awọn laini sẹẹli transgenic ni iduroṣinṣin ti n ṣalaye ami ami microtubule TagRFP-TUA6 tabi asamisi filament actin GFP-ABD2 labẹ ọlọjẹ ori ododo irugbin bi ẹfọ 35S olupolowo ni ipilẹṣẹ bi a ti ṣalaye33,34,35.Awọn laini sẹẹli wọnyi le ṣe itọju ati muṣiṣẹpọ ni lilo awọn ilana ti o jọra si awọn ti a lo fun atilẹba laini sẹẹli BY-2.
Awọn sẹẹli HeLa ti gbin ni Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye) ti o ni afikun pẹlu 10% omi ara inu oyun, 1.2 U/ml penicillin, ati 1.2 μg/ml streptomycin ni incubator 37°C pẹlu 5% CO2.
Gbogbo awọn idanwo ti a ṣalaye ninu iwe afọwọkọ yii ni a ṣe ni ibamu pẹlu awọn ilana ati awọn ilana biosafety Japanese.
Awọn akojọpọ ti wa ni tituka ni dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Kemikali) bi awọn ojutu iṣura ati ti fomi po ni MS alabọde fun Arabidopsis ati taba tabi Gamborg B5 alabọde fun liverwort.Fun idanwo idinamọ idagbasoke gbongbo, diẹ sii ju awọn irugbin 10 fun awo kan ni a gbin lori alabọde agar ti o ni awọn agbo-itọka itọkasi tabi DMSO.Awọn irugbin ti wa ni idawọle ni iyẹwu idagbasoke fun ọjọ 7.Awọn irugbin ti ya aworan ati ipari ti awọn gbongbo ti wọn.Fun idanwo germination Arabidopsis, awọn irugbin 48 fun awo kan ni a gbin lori alabọde agar ti o ni 200 μM yellow tabi DMSO.Awọn irugbin Arabidopsis ti dagba ni iyẹwu idagba ati nọmba awọn irugbin ti o dagba ni a ka awọn ọjọ 7 lẹhin germination (dag).Fun idanwo germination taba, awọn irugbin 24 fun awo kan ni a gbin lori alabọde agar ti o ni 200 μM KAND tabi DMSO.Awọn irugbin taba ti dagba ni iyẹwu idagba ati nọmba awọn irugbin ti o dagba ni a ka lẹhin ọjọ 14.Fun idanwo idinamọ idagbasoke liverwort, awọn ọmọ inu oyun 9 lati awo kọọkan ni a fi sii lori alabọde agar ti o ni awọn ifọkansi itọkasi ti KAND tabi DMSO ati ti a fi sinu iyẹwu idagba fun awọn ọjọ 14.
Lo awọn irugbin ti o ni abawọn pẹlu 5 miligiramu/ml propidium iodide (PI) lati wo eto eto meristem root.Awọn ifihan agbara PI ni a ṣe akiyesi nipasẹ maikirosikopu fluorescence nipa lilo microscope ọlọjẹ confocal TCS SPE kan (Leica Microsystems).
Abawọn histochemical ti awọn gbongbo pẹlu β-glucuronidase (GUS) ni a ṣe ni ibamu si ilana ti a ṣalaye nipasẹ Malami ati Benfey36.Awọn irugbin ti o wa titi ni 90% acetone ni alẹ, ti o ni abawọn pẹlu 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ni GUS buffer fun wakati 1 ati gbe sinu ojutu chloraldehyde ti o ni omi.(8 g chloral hydrate, 2 milimita omi ati 1 milimita glycerol) ati pe a ṣe akiyesi nipasẹ kikọlu iyatọ iyatọ maikirosikopu nipa lilo microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Awọn igun gbongbo ni a wọn lori awọn irugbin ọjọ-7 ti o dagba lori awọn awo ti a gbe ni inaro.Ṣe iwọn igun ti gbongbo lati itọsọna ti fekito walẹ bi a ti ṣalaye ni igbesẹ 6.
Eto ti awọn microtubules cortical ni a ṣe akiyesi bi a ti ṣalaye, pẹlu awọn iyipada kekere si ilana 37.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millpore: MAB3408) ati Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ni a lo bi awọn egboogi akọkọ ati atẹle ni 1: 1000 ati 1: 100 dilutions, lẹsẹsẹ.Awọn aworan Fluorescence ni a gba ni lilo microscope ọlọjẹ confocal TCS SPE kan (Leica Microsystems).Gba awọn aworan akopọ Z ki o ṣẹda awọn asọtẹlẹ kikankikan ti o pọju ni ibamu si awọn ilana olupese.
Ayẹwo isanwo sẹẹli HeLa ni a ṣe pẹlu lilo Apo kika Cell 8 (Dojindo) ni ibamu si awọn ilana olupese.
Idagba ti E. coli DH5a ni a ṣe ayẹwo nipasẹ wiwọn iwuwo sẹẹli ni aṣa nipa lilo spectrophotometer ni 600 nm (OD600).
Ajọpọ cytoskeletal ni awọn sẹẹli transgenic BY-2 ni a ṣe akiyesi lilo microscope fluorescence ti o ni ipese pẹlu ẹrọ ọlọjẹ confocal CSU-X1 (Yokogawa) ati kamẹra sCMOS (Zyla, Andor Technology).A ṣe ayẹwo iwuwo cytoskeletal nipasẹ itupalẹ aworan, eyiti o ṣe iwọn ipin ogorun awọn piksẹli cytoskeletal laarin awọn piksẹli cytoplasmic ni awọn aworan confocal nipa lilo sọfitiwia ImageJ bi a ti ṣalaye38,39.
Lati ṣe awari iku sẹẹli ni awọn sẹẹli BY-2, aliquot ti idaduro sẹẹli jẹ idawọle pẹlu 0.05% Evans blue fun awọn iṣẹju 10 ni iwọn otutu yara.Yiyan Evans awọ buluu ti awọn sẹẹli ti o ku da lori extrusion ti awọ lati awọn sẹẹli ti o le yanju nipasẹ awọ pilasima ti o ni mimu40.A ṣe akiyesi awọn sẹẹli ti o ni abawọn nipa lilo maikirosikopu aaye-imọlẹ (BX53, Olympus).
Awọn sẹẹli HeLa ti dagba ni DMEM ni afikun pẹlu 10% FBS ni incubator ti o tutu ni 37°C ati 5% CO2.A ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), tabi 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) fun 6 h ni 37 ° C.A ṣe atunṣe awọn sẹẹli pẹlu MetOH fun awọn iṣẹju 10 ati lẹhinna pẹlu acetate fun awọn iṣẹju 5 ni iwọn otutu yara.Awọn sẹẹli ti o wa titi ni a fi sii pẹlu β-tubulin akọkọ antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ti fomi po ni 0.5% BSA/PBS fun awọn wakati 2, ti a fo ni igba 3 pẹlu TBST, ati lẹhinna ni afikun pẹlu Alexa Fluor goat antibody.488 1 aago.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ati 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ti fomi po ni 0.5% BSA/PBS.Lẹhin fifọ pẹlu TBST ni igba mẹta, a ṣe akiyesi awọn sẹẹli ti o ni abawọn lori Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope.Awọn aworan ni a ya pẹlu kamẹra Hamamatsu ORCA-R2 CCD ti o tutu nipa lilo sọfitiwia MetaMorph (Awọn ẹrọ Molecular).
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹta-17-2024