Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ aṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀. Fún àwọn àbájáde tó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀yà tuntun ti ẹ̀rọ aṣàwárí yín (tàbí kí ẹ má ṣe pa Ìbáramu Ipò nínú Internet Explorer mọ́). Ní báyìí ná, láti rí i dájú pé àtìlẹ́yìn ń lọ lọ́wọ́, a ń fi ojú òpó náà hàn láìsí ìrísí tàbí JavaScript.
Àwárí àti lílo àwọn ọjà àdánidá ní àǹfààní lè ran ènìyàn lọ́wọ́ láti mú ìgbésí ayé wọn sunwọ̀n síi. Àwọn kẹ́míkà tí ó ń dènà ìdàgbàsókè ewéko ni a ń lò gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìtọ́jú ewéko láti ṣàkóso èpò. Nítorí àìní láti lo oríṣiríṣi àwọn ohun èlò ìtọ́jú ewéko, ó ṣe pàtàkì láti dá àwọn ohun èlò tí ó ní àwọn ọ̀nà ìṣiṣẹ́ tuntun mọ̀. Nínú ìwádìí yìí, a ṣàwárí ohun èlò tuntun kan tí a ń pè ní N-alkoxypyrrole, coumamonamide, láti Streptomyces werraensis MK493-CF1, a sì dá ìlànà ìṣẹ̀dá gbogbo rẹ̀ sílẹ̀. Nípasẹ̀ àwọn àyẹ̀wò ìṣiṣẹ́ ẹ̀dá alààyè, a ṣàwárí pé urs-monoamic acid jẹ́ ààlà ìṣiṣẹ́ ara ti urs-monoamide àti agbára kan.idilọwọ idagbasoke ọgbinNí àfikún, a ti ṣe àgbékalẹ̀ onírúurú àwọn ohun èlò ìtọ́jú urbenonic acid, títí kan urbenyloxy derivative (UDA), èyí tí ó ní ìṣiṣẹ́ ìpalára ewéko gíga láìsí ìpalára búburú nínú ìdàgbàsókè àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa. A tún rí i pé àwọn ohun èlò ìtọ́jú urmotonic acid ń da àwọn microtubules ewéko rú; ní àfikún, KAND ń ní ipa lórí àwọn filaments actin ó sì ń fa ikú sẹ́ẹ̀lì; Àwọn ipa onírúurú wọ̀nyí yàtọ̀ sí ti àwọn ohun èlò ìdènà microtubule tí a mọ̀, wọ́n sì dámọ̀ràn ọ̀nà tuntun láti ṣiṣẹ́ fún ursonic acid, èyí tí ó dúró fún àǹfààní pàtàkì nínú ìdàgbàsókè àwọn ohun èlò ìtọ́jú ewéko tuntun.
Àwárí àti lílo àwọn ọjà àdánidá tó wúlò àti àwọn ohun tí wọ́n yọrí sí rere jẹ́ ọ̀nà láti mú kí ìgbésí ayé ènìyàn dára síi. Àwọn èròjà ìbílẹ̀ kejì tí àwọn ohun alumọ́ọ́nì, ewéko àti kòkòrò ń ṣe ti yọrí sí ìlọsíwájú pàtàkì nínú iṣẹ́ abẹ àti iṣẹ́ àgbẹ̀. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ oògùn apàrokò àti oògùn apàrokò àrùn jẹjẹrẹ ni a ti ṣe láti inú àwọn ọjà àdánidá. Ní àfikún, onírúurú irúàwọn ipakokoropaeku, àwọn ohun èlò ìpakúpa àti àwọn ohun èlò ìpakúpa ni a máa ń yọ láti inú àwọn ọjà àdánidá wọ̀nyí fún lílò nínú iṣẹ́ àgbẹ̀. Ní pàtàkì, àwọn ohun èlò ìpakúpa èpò jẹ́ irinṣẹ́ pàtàkì fún mímú èso oko pọ̀ sí i ní iṣẹ́ àgbẹ̀ òde òní, àti pé onírúurú àwọn ohun èlò ìpakúpa ni a ti ń lò ní ọjà. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìlànà sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn ohun ọ̀gbìn, bíi photosynthesis, amino acid metabolism, synthesis wall cell, regulating of mitosis, phytohormone signaling, tàbí protein synthesis, ni a kà sí àwọn ibi tí àwọn ohun èlò ìpakúpa jẹ́. Àwọn ohun èlò tí ó ń dí iṣẹ́ microtubule lọ́wọ́ jẹ́ irú àwọn ohun èlò ìpakúpa tí ó wọ́pọ̀ tí ó ní ipa lórí ìdàgbàsókè ohun ọ̀gbìn nípa níní ipa lórí ìlànà mitotic2.
Microtubules jẹ́ àwọn èròjà cytoskeleton, wọ́n sì wà ní ìpamọ́ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì eukaryotic. Tubulin heterodimer ní α-tubulin àti β-tubulin tí ó ń ṣe àwọn protofilaments microtubule linear, pẹ̀lú àwọn protofilaments 13 tí wọ́n ń ṣe ìṣètò cylindrical. Microtubules ń kó ipa púpọ̀ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko, títí bí pípinnu ìrísí sẹ́ẹ̀lì, pípín sẹ́ẹ̀lì, àti gbigbe intracellular3,4. Àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko ní àwọn microtubules lábẹ́ interphase plasma membrane, àti àwọn ohun tí a ń pè ní cortical microtubules wọ̀nyí ni a rò pé wọ́n ń ṣàkóso ìṣètò àwọn microfibrils cellulose nípasẹ̀ ìṣètò àwọn complexes cellulose synthase4,5. Àwọn microtubules cortical ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal gbòǹgbò, tí ó wà ní agbègbè ìtẹ̀síwájú kíákíá ti orí gbòǹgbò, wà ní ìta, àwọn microfibers cellulose sì ń tẹ̀lé àwọn microtubules wọ̀nyí wọ́n sì ń dín ìtọ́sọ́nà ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì kù, nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n ń gbé ìtẹ̀síwájú sẹ́ẹ̀lì anisotropic lárugẹ. Nítorí náà, iṣẹ́ microtubule ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú ìrísí ewéko. Àwọn ìyípadà amino acid nínú àwọn jínì tí ó ń yí tubulin padà máa ń fa ìyípadà nínú àwọn ìlà cortical microtubule àti ìdàgbàsókè apá òsì tàbí apá ọ̀tún nínú Arabidopsis 6,7. Bákan náà, àwọn ìyípadà nínú àwọn protein tí ó ní í ṣe pẹ̀lú microtubule tí ó ń ṣàkóso ìṣiṣẹ́ microtubule tún lè yọrí sí ìdàgbàsókè gbòǹgbò tí kò dára8,9,10,11,12,13. Ní àfikún, ìtọ́jú pẹ̀lú àwọn oògùn herbicide tí ń dí microtubule lọ́wọ́ bíi disopyramide, tí a tún mọ̀ sí pretilachlor, tún ń fa ìdàgbàsókè gbòǹgbò apá òsì tí ó ní ìdènà14. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé ìlànà pípéye ti iṣẹ́ microtubule ṣe pàtàkì fún pípinnu ìtọ́sọ́nà ìdàgbàsókè ewéko.
A ti ṣàwárí onírúurú àwọn ìdènà microtubule, àwọn oògùn wọ̀nyí sì ti ṣe àfikún pàtàkì sí ìwádìí cytoskeletal, àti sí iṣẹ́ àgbẹ̀ àti ìṣègùn2. Ní pàtàkì, oryzalin, àwọn àdàpọ̀ dinitroaniline, disopyramide, àwọn àdàpọ̀ tí ó ní í ṣe pẹ̀lú benzamide, àti àwọn analogu wọn lè dí iṣẹ́ microtubule lọ́wọ́ kí wọ́n sì dín ìdàgbàsókè ewéko kù. Nítorí náà, a ń lò wọ́n ní gbogbogbòò gẹ́gẹ́ bí ewéko herbicide. Síbẹ̀síbẹ̀, níwọ̀n ìgbà tí microtubules jẹ́ apá pàtàkì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko àti ẹranko, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìdènà microtubule jẹ́ cytotoxic sí àwọn irú sẹ́ẹ̀lì méjèèjì. Nítorí náà, láìka àǹfààní wọn sí gẹ́gẹ́ bí ewéko herbicide, iye díẹ̀ lára àwọn aṣojú antimicrotubule ni a lò fún àwọn ète ìṣe.
Streptomyces jẹ́ irú ìdílé Streptomyces, èyí tí ó ní bakitéríà aerobic, gram-positive, àti filamentous nínú, a sì mọ̀ ọ́n fún agbára rẹ̀ láti ṣe onírúurú àwọn metabolites kejì. Nítorí náà, a kà á sí ọ̀kan lára àwọn orísun pàtàkì jùlọ fún àwọn ọjà àdánidá tuntun tí ń ṣiṣẹ́ ní ìpele ìbílẹ̀. Nínú ìwádìí lọ́wọ́lọ́wọ́, a ṣàwárí èròjà tuntun kan tí a ń pè ní coumamonamide, èyí tí a yà sọ́tọ̀ láti inú Streptomyces werraensis MK493-CF1 àti S. werraensis ISP 5486. Nípa lílo ìwádìí ìwòran àti ìwádìí ìwòran pípé, a ṣe àfihàn ìṣètò coumamonamide àti pé a pinnu ìṣẹ̀dá egungun N-alkoxypyrrole rẹ̀. ìṣẹ̀dá. Ursmonic acid, àárín àgbékalẹ̀ ìṣẹ̀dá ti ursmonoamide àti àwọn ìṣẹ̀dá rẹ̀, ni a rí láti dí ìdàgbàsókè àti ìbísí ti ohun ọ̀gbìn àwòṣe tí ó gbajúmọ̀ Arabidopsis thaliana lọ́wọ́. Nínú ìwádìí ìbáṣepọ̀ ìṣètò àti ìṣiṣẹ́, a rí i pé èròjà kan tí ó ní C9 tí a yípadà sí ursonic acid, tí a ń pè ní nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), mú kí ipa ìdènà pọ̀ sí i lórí ìdàgbàsókè àti ìbísí pọ̀ sí i ní pàtàkì. Lọ́nà pàtàkì, àwọn ohun tí ó ń dènà ìdàgbàsókè ewéko tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ rí náà tún ní ipa lórí ìdàgbàsókè tábà àti liverwort, kò sì jẹ́ ohun tí ó lè fa àrùn bakitéríà tàbí àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ohun tí ó ń fa àrùn urmotonic acid kan ń fa ìrísí gbòǹgbò tí ó yípadà, tí ó túmọ̀ sí pé àwọn ohun tí ó ń fa àrùn wọ̀nyí ní ipa taara tàbí láìtaara lórí àwọn microtubules. Gẹ́gẹ́ bí èrò yìí, àwọn àkíyèsí wa nípa àwọn microtubules tí a fi àmì sí bóyá immunohistochemically tàbí pẹ̀lú àwọn protein fluorescent fihàn pé ìtọ́jú KAND ń yọ àwọn microtubules kúrò. Ní àfikún, ìtọ́jú pẹ̀lú àwọn ohun tí ó ń fa àrùn kumamotonic acid ń ba àwọn microfilaments actin jẹ́. Nítorí náà, a ti ṣàwárí ohun tí ó ń dènà ìdàgbàsókè ewéko tuntun tí ọ̀nà ìṣiṣẹ́ rẹ̀ jẹ́ ti ìparun cytoskeleton.
A ya ìpara MK493-CF1 sọ́tọ̀ kúrò nínú ilẹ̀ ní Shinagawa-ku, Tokyo. Ìpara MK493-CF1 ṣẹ̀dá mycelium stromal tó ní ẹ̀ka tó dáa. A pinnu ìtẹ̀léra díẹ̀ lára ìran RNA ribosomal 16S (1422 bp). Ìpara yìí jọra gan-an pẹ̀lú S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ìpara tó wọ́pọ̀, 99.93%). Nítorí àbájáde yìí, a pinnu pé ìpara yìí ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú irú ìpara S. werraensis. Nítorí náà, a fún ìpara yìí ní orúkọ fún ìgbà díẹ̀. S. werraensis ISP 5486T tún ń ṣe àwọn èròjà bioactive kan náà. Nítorí pé ìwádìí díẹ̀ ló wà ní ìbẹ̀rẹ̀ láti rí àwọn ọjà àdánidá láti inú microorganism yìí, a ṣe ìwádìí kẹ́míkà síwájú sí i. Lẹ́yìn gbígbin S. werraensis MK493-CF1 lórí ọkà barle nípa lílo ìpara solid-state fermentation ní 30°C fún ọjọ́ mẹ́rìnlá, a yọ ohun èlò náà jáde pẹ̀lú 50% EtOH. A gbẹ 60 milimita ti àpẹẹrẹ náà láti gba 59.5 miligiramu ti ohun èlò robi. A fi ìyọkúrò robi náà lé HPLC láti fún N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, tí a ń pè ní coumamonamide, 36.0 mg). Iye àpapọ̀ 1 jẹ́ nǹkan bí 60% ti ohun èlò robi. Nítorí náà, a pinnu láti ṣe àyẹ̀wò àwọn ànímọ́ kumamotoamide 1 ní kíkún.
Coumamonamide 1 jẹ́ lulú funfun amorphous àti spectrometry mass resolution high resolution (HRESIMS) jẹ́rìí sí C6H8N2O2 (Àwòrán 1). Ẹ̀yà pyrrole tí a rọ́pò C2 ti èròjà yìí ni a fi δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH nínú 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) àti δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), àti 13C NMR spectrum fi wíwà àwọn átọ̀mù erogba sp2 mẹ́rin hàn. A ṣe àyẹ̀wò wíwà ẹgbẹ́ amide kan ní ipò C2 nípa lílo ìbáṣepọ̀ HMBC láti C-3 proton sí amide carbon carbon ní δC 161.1. Ní àfikún, 1 H àti 13 C NMR ń ga ní δH 4.10 (3H, S) àti δC 68.3 fi hàn pé àwọn ẹgbẹ́ N-methoxy wà nínú molecule náà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a kò tíì mọ ipò tó tọ́ ti ẹgbẹ́ methoxy nípa lílo ìwádìí spectroscopic bíi enhanced difference spectroscopy àti nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide di àkójọpọ̀ àkọ́kọ́ tí ó yẹ kí ó wà.
Láti mọ ìṣètò tó tọ́ ti 1, a ṣe àkópọ̀ gbogbo rẹ̀ (Àwòrán 2a). Ìtọ́jú 2-aminopyridine 2 tó wà ní ọjà pẹ̀lú m-CPBA yọrí sí N-oxide 3 tó báramu ní ìṣàn iye. Lẹ́yìn 2-aminoazidation ti 2, a ṣe àgbékalẹ̀ cyclocondensation tí Abramovich ṣàlàyé ní benzene ní 90°C láti gba 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 tí a fẹ́ ní giramu. Ìyára 60% (ìpele méjì). 15,16. Methylation àti hydrolysis ti 4 lẹ́yìn náà fún 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (tí a pè ní “cumotonic acid”, 6) ní ìṣàn tó dára (70%, ìpele méjì). Níkẹyìn, amidation nípasẹ̀ acid chloride integrate 6 nípa lílo ammonia omi fún Kumamoto amide 1 ní ìṣàn 98%. Gbogbo ìwífún nípa spectral ti synthesized 1 jọra sí 1 tí a yà sọ́tọ̀, nítorí náà a pinnu ìṣètò 1;
Ìṣẹ̀dá gbogbogbò àti ìṣàyẹ̀wò ìṣiṣẹ́ ẹ̀dá-ara ti urbenamide àti urbenic acid. (a) Ìṣẹ̀dá àpapọ̀ Kumamoto amide. (b) A gbin àwọn irugbin Arabidopsis Columbia (Col) onírú ọjọ́ méje tí ó jẹ́ ọjọ́ méje lórí àwọn àwo Murashige àti Skoog (MS) tí ó ní coumamonamide 6 tàbí coumamonamide 1 ní àwọn ìwọ́n tí a fihàn. Ìwọ̀n ìwọ̀n = 1 cm.
Àkọ́kọ́, a ṣe àyẹ̀wò àwọn ìgbòkègbodò ẹ̀dá-ara ti urbenamide àti àwọn ohun tí ó wà láàárín rẹ̀ fún agbára wọn láti ṣe àtúnṣe ìdàgbàsókè ewéko. A fi onírúurú ìfojúsùn ursmonamide 1 tàbí ursmonic acid 6 kún àwọn irugbin agar alabọde MS àti àwọn irugbin Arabidopsis thaliana tí a gbìn lórí ohun èlò yìí. Àwọn àyẹ̀wò wọ̀nyí fihàn pé ìfojúsùn gíga (500 μM) ti 6 dí ìdàgbàsókè gbòǹgbò lọ́wọ́ (Àwòrán 2b). Lẹ́yìn náà, a ṣe onírúurú ìfojúsùn nípa fífi ipò N1 ti 6 rọ́pò wọn, a sì ṣe àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ ìbáṣepọ̀ ìṣètò àti ìgbòkègbodò lórí wọn (ìlànà ìṣẹ̀dá analogu ni a ṣàlàyé nínú Àlàyé Àtìlẹ́yìn (SI)). A gbìn àwọn irugbin Arabidopsis lórí ohun èlò tí ó ní 50 μM ursonic acid derivatives, a sì wọn gígùn gbòǹgbò. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn lórí àwòrán náà. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àwòrán 3a, b, àti S1, àwọn acids coumamo ní àwọn gígùn ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ ti àwọn ẹ̀wọ̀n alkoxy linear (9, 10, 11, 12, àti 13) tàbí àwọn ẹ̀wọ̀n alkoxy ńlá (15, 16, àti 17) ní ipò N1. Àwọn ohun tí a fi ṣe àtúnṣe náà fi ìdíwọ́ pàtàkì hàn fún ìdàgbàsókè gbòǹgbò. Ní àfikún, a rí i pé lílo 200 μM 10, 11, tàbí 17 ló dí ìdàgbàsókè lọ́wọ́ (Àwòrán 3c àti S2).
Ìkẹ́kọ̀ọ́ nípa ìbáṣepọ̀ ìṣètò àti ìṣiṣẹ́ ti Kumamoto amide àti àwọn èròjà tí ó jọra. (a) Ètò ìṣètò àti ìṣẹ̀dá àwọn analogues. (b) Ìwọ̀n gígùn gbòǹgbò àwọn irugbin ọjọ́ méje tí a gbìn lórí MS pẹ̀lú tàbí láìsí 50 μM àwọn ìtọ́kasí coumamonamide. Àwọn àmì ìràwọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn pẹ̀lú ìtọ́jú àfọwọ́kọ (ìdánwò t, p< 0.05). n>18. A fi data han bi apapọ ± SD. nt tumọ si “a ko ti danwo” nitori pe diẹ sii ju 50% awọn irugbin naa ko dagba. (c) Iye oṣuwọn idagbasoke ti awọn irugbin ti a ti tọju ti a fi sinu ibi ipamọ fun ọjọ meje ninu alabọde MS pẹlu tabi laisi 200 μM coumamonamide ati awọn agbo ogun ti o jọmọ. Awọn aami irawọ fihan awọn iyatọ pataki pẹlu itọju sham (idanwo chi-square). n=96.
Ó yani lẹ́nu pé, fífi àwọn ẹ̀wọ̀n ẹ̀gbẹ́ alkyl tí ó gùn ju C9 lọ dín ìṣiṣẹ́ ìdènà kù, èyí tí ó fihàn pé àwọn èròjà tí ó ní í ṣe pẹ̀lú kumamotoic acid nílò àwọn ẹ̀wọ̀n ẹ̀gbẹ́ tí ó ní ìwọ̀n kan láti fi ìṣiṣẹ́ ẹ̀dá wọn hàn.
Nítorí pé ìṣàyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ ìṣètò àti ìṣiṣẹ́ fihàn pé a ṣe àtúnṣe C9 sí ursonic acid àti pé àtúnṣe nonyloxy ti ursonic acid (tí a ń pè ní KAND 11 lẹ́yìn náà) ni olùdínà ìdàgbàsókè ewéko tí ó munadoko jùlọ, a ṣe àfihàn KAND 11 ní kíkún. Ìtọ́jú Arabidopsis pẹ̀lú 50 μM KAND 11 fẹ́rẹ̀ dènà ìdàgbàsókè pátápátá, nígbàtí àwọn ìfojúsùn tí ó kéré síi (40, 30, 20, tàbí 10 μM) ti KAND 11 dí ìdàgbàsókè gbòǹgbò lọ́wọ́ ní ọ̀nà tí ó sinmi lórí ìwọ̀n (Àwòrán 4a, b). Láti dán wò bóyá KAND 11 ní ipa lórí bí root meristem ṣe lè ṣiṣẹ́, a ṣe àyẹ̀wò root meristems tí a fi propidium iodide (PI) ṣe àwọ̀, a sì wọn ìwọ̀n agbègbè meristem. Ìwọ̀n meristem ti àwọn irugbin tí a gbìn lórí ohun tí ó ní 25 μM KAND-11 jẹ́ 151.1 ± 32.5 μm, nígbà tí ìwọ̀n meristem ti àwọn irugbin tí a gbìn lórí ohun tí a fi DMSO ṣe ìṣàkóso jẹ́ 264.7 ± 30.8 μm (Àwòrán 4c, d), èyí tí ó fihàn pé KAND-11 ń mú iṣẹ́ sẹ́ẹ̀lì padà bọ̀ sípò. tànkálẹ̀. Root meristem. Gẹ́gẹ́ bí èyí, ìtọ́jú KAND 11 dín iye àmì ìpín sẹ́ẹ̀lì CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS kù nínú root meristem (Àwòrán 4e) 17. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé KAND 11 ń dí ìdàgbàsókè gbòǹgbò lọ́wọ́ nípa dídín ìṣiṣẹ́ ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì kù.
Àgbéyẹ̀wò ipa ìdíwọ́ ti àwọn ohun èlò ìdènà urbenonic acid (urbenyloxy derivatives) lórí ìdàgbàsókè. (a) Àwọn irugbin Col irú-ọjọ́ méje tí a gbìn lórí àwọn àwo MS pẹ̀lú ìwọ̀n KAND 11 tí a fihàn. Páàtì ìwọ̀n = 1 cm. (b) Ìwọ̀n gígùn gbòǹgbò. Àwọn lẹ́tà fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn (Ìdánwò Tukey HSD, p< 0.05). n>16. A fi data hàn gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SD. (c) Onímọ̀ ìjìnlẹ̀ Confocal ti gbòǹgbò Col irú-ẹran propidium iodide tí a fi iodide ṣe tí a gbìn sórí àwọn àwo MS pẹ̀lú tàbí láìsí 25 μM KAND 11. Àwọn àmì funfun fi gbòǹgbò meristem hàn. Ìwọ̀n ìwọ̀n = 100 µm. (d) Ìwọ̀n ìwọ̀n gbòǹgbò meristem (n = 10 sí 11). A pinnu àwọn ìyàtọ̀ ìṣirò nípa lílo t-test (p< 0.05). Àwọn ọ̀pá náà dúró fún ìwọ̀n meristem tó wọ́pọ̀. (e) Ìwòran ìdènà ìyàtọ̀ (DIC) ti meristem gbòǹgbò tó ní ìkọ́lé CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS tí a ti fi àwọ̀ bò tí a sì ti fi àwọ̀ bò lórí àwọn igi ọjọ́ márùn-ún tí a gbìn lórí àwọn àwo MS pẹ̀lú tàbí láìsí àyẹ̀wò KAND 25 µM.
A tún dán an wò nípa lílo ewéko dicotyledonous mìíràn, tábà (Nicotiana tabacum), àti ohun alààyè kan tí ó jẹ́ àpẹẹrẹ ewéko ilẹ̀, liverwort (Marchantia polymorpha). Gẹ́gẹ́ bí ó ti rí ní ti Arabidopsis, àwọn ewéko tábà SR-1 tí a gbìn sí orí ilẹ̀ tí ó ní 25 μM KAND 11 mú gbòǹgbò kúkúrú jáde (Àwòrán 5a). Ní àfikún, 40 nínú 48 irúgbìn ló hù jáde lórí àwọn àwo tí ó ní 200 μM KAND 11, nígbà tí gbogbo irúgbìn 48 náà hù jáde lórí àwọn ohun èlò tí a fi ọwọ́ ṣe, èyí tí ó fihàn pé ìwọ́n KAND tí ó ga jùlọ ṣe pàtàkì (p< 0.05; chi test -square) dí ìbísí tábà lọ́wọ́. (Àwòrán 5b). Ní àfikún, ìpele KAND 11 tí ó dí ìbísí bakitéríà nínú liverwort jẹ́ bí ìpele tó gbéṣẹ́ nínú Arabidopsis (Àwòrán 5c). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé KAND 11 lè dí ìbísí onírúurú ewéko lọ́wọ́. Lẹ́yìn náà, a ṣe ìwádìí nípa ìbàjẹ́ tó ṣeé ṣe nínú àwọn èròjà tó ní í ṣe pẹ̀lú bear monoamide nínú àwọn ohun alààyè mìíràn, èyí ni àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa ènìyàn àti Escherichia coli strain DH5α, gẹ́gẹ́ bí àwọn aṣojú àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹranko àti bakitéríà tó ga jùlọ, ní ìtẹ̀léra. Nínú àwọn àyẹ̀wò ìbísí sẹ́ẹ̀lì, a ṣàkíyèsí pé coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, àti KAND 11 kò ní ipa lórí ìbísí àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa tàbí E. coli ní ìpele 100 μM (Àwòrán 5d,e).
Dídínà ìdàgbàsókè KAND 11 nínú àwọn ohun alààyè tí kìí ṣe Arabidopsis. (a) A gbin àwọn irugbin taba SR-1 irú ìgbẹ́ ọ̀sẹ̀ méjì lórí àwọn àwo MS tí a gbé kalẹ̀ ní gígùn tí ó ní 25 μM KAND 11. (b) A gbin àwọn irugbin taba SR-1 irú ìgbẹ́ ọ̀sẹ̀ méjì lórí àwọn àwo MS tí a gbé kalẹ̀ ní gígùn tí ó ní 200 μM KAND 11. (c) Àwọn èèpo Tak-1 irú ìgbẹ́ ọ̀sẹ̀ méjì tí a gbìn lórí àwọn àwo Gamborg B5 pẹ̀lú àwọn ìfọ́pọ̀ KAND 11 tí a fihàn. Àwọn ọfà pupa fi àwọn spores tí wọ́n dáwọ́ dúró láti dàgbà láàárín àkókò ìfàsẹ́yìn ọ̀sẹ̀ méjì náà hàn. (d) Ìwádìí ìfàsẹ́yìn sẹ́ẹ̀lì ti àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa. A wọn iye àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ṣeé ṣe ní àwọn àkókò tí a ti pinnu nípa lílo ohun èlò kíkà sẹ́ẹ̀lì 8 (Dojindo). Gẹ́gẹ́ bí ìdarí, a fi 5 μg/ml actinomycin D (Act D) tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa, èyí tí ó ń dí ìkọ̀wé RNA polymerase lọ́wọ́ tí ó sì ń fa ikú sẹ́ẹ̀lì. A ṣe àwọn àyẹ̀wò ní ìlọ́po mẹ́ta. (e) Ìwádìí ìfàsẹ́yìn sẹ́ẹ̀lì E. coli. A ṣe àyẹ̀wò ìdàgbàsókè E. coli nípa wíwọ̀n OD600. Gẹ́gẹ́ bí ìdarí, a fi 50 μg/ml ampicillin (Amp) tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì, èyí tí ó ń dí ìṣẹ̀dá àwọn sẹ́ẹ̀lì bakitéríà lọ́wọ́. A ṣe àyẹ̀wò ní ìpele mẹ́ta.
Láti mọ bí àwọn èròjà ìfàjẹ̀sín-ẹ̀jẹ̀-ara-ẹni-ṣe-nǹkan ... Àwọn àkójọpọ̀ 8, 9, àti 15 yí ìtọ́sọ́nà ìdàgbàsókè gbòǹgbò padà ní 75 μM, 50 μM, àti 40 μM, lẹ́sẹẹsẹ, èyí tí ó fihàn pé àwọn àkójọpọ̀ wọ̀nyí lè ba àwọn microtubules jẹ́ ní ọ̀nà tí ó dára (Àwòrán 2b, 6a). A tún dán àwọn ohun tí ó jẹ́ àbájáde ursolic acid tí ó lágbára jùlọ wò, KAND 11, ní ìwọ̀n tí ó kéré síi (15 µM) a sì rí i pé lílo KAND 11 dí ìdàgbàsókè gbòǹgbò lọ́wọ́ àti pé ìtọ́sọ́nà ìdàgbàsókè gbòǹgbò kò dọ́gba, bó tilẹ̀ jẹ́ pé wọ́n sábà máa ń tẹ̀ sí apá òsì (Àwòrán C3). Nítorí pé àwọn ìfọ́pọ̀ gíga ti àwọn oògùn tí ń dín ìdàgbàsókè microtubule kù nígbà míì máa ń dí ìdàgbàsókè ewéko lọ́wọ́ dípò kí ó fa ìtẹ̀sí gbòǹgbò, lẹ́yìn náà a ṣe àyẹ̀wò ìṣeéṣe náà pé KAND 11 ní ipa lórí àwọn microtubules nípa ṣíṣàkíyèsí àwọn microtubules cortical nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì root epidermal. Immunohistochemistry nípa lílo anti-β-tubulin antibodies nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal ti àwọn gbòǹgbò seedling tí a fi 25 μM KAND 11 tọ́jú fi hàn pé gbogbo àwọn microtubules cortical pípàdánù nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal ní agbègbè ìtẹ̀síwájú (Àwòrán 6b). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé kumamotonic acid àti àwọn ohun tí ó yọrí sí i ń ṣiṣẹ́ tààrà tàbí láìṣe tààrà lórí àwọn microtubules láti da wọ́n rú àti pé àwọn èròjà wọ̀nyí jẹ́ àwọn ohun tí ó ń dènà microtubule tuntun.
Ursonic acid àti àwọn ohun tí ó yọrí sí i ń yí àwọn microtubules cortical padà nínú Arabidopsis thaliana. (a) A wọ́n igun ìtẹ̀sí gbòǹgbò ní iwájú onírúurú àwọn ohun tí ó yọrí sí urmotonic acid ní àwọn ìpele tí a fihàn. A tún ṣàyẹ̀wò àwọn ipa àwọn ohun méjì tí a mọ̀ sí dídínà microtubules: disopyramide àti oryzalin. Àwòrán inú rẹ̀ fi ìwọ̀n tí a lò láti wọn igun ìdàgbàsókè gbòǹgbò hàn. Àwọn àmì ìràwọ̀ fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn pẹ̀lú ìtọ́jú àbùkù (t test, p< 0.05). n>19. Àmì ìwọ̀n = 1 cm. (b) Àwọn microtubules cortical nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal ní agbègbè gígùn. Àwọn microtubules nínú irú Arabidopsis onírúurú ẹranko ni a fi àmì ìtọ́jú ara hàn pẹ̀lú tàbí láìsí 25 μM KAND 11 nípa lílo àwọn antibodies β-tubulin primary àti àwọn antibodies secondary Alexa Fluor-conjugated. Àmì ìwọ̀n = 10 µm. (c) Ìṣètò Mitotic ti àwọn microtubules nínú gbòǹgbò meristem. A fi àmì immunohistochemical hàn àwọn microtubules. A ka àwọn ìṣètò Mitotic, pẹ̀lú àwọn agbègbè prophase, spindles, àti phragmoplasts, láti inú àwọn àwòrán confocal. Àwọn ọfà fi àwọn ìṣètò mitotic microtubule hàn. Àwọn àmì ìràwọ̀ fi àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì hàn pẹ̀lú ìtọ́jú sham (ìdánwò t, p< 0.05). n>9. Ìwọ̀n ìpele = 50 µm.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé Ursa ní agbára láti ba iṣẹ́ microtubule jẹ́, a retí pé ọ̀nà ìṣe rẹ̀ yóò yàtọ̀ sí àwọn aṣojú microtubule depolymerizing tí ó wọ́pọ̀. Fún àpẹẹrẹ, ìpele gíga ti àwọn aṣojú microtubule depolymerizing bíi disopyramide àti oryzalin fa ìfẹ̀sí anisotropic ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal, nígbà tí KAND 11 kò fa. Ní àfikún, lílo KAND 11 àti disopyramide papọ̀ yọrí sí ìdáhùn ìdàgbàsókè gbòǹgbò tí disopyramide fa àti ìdínà ìdàgbàsókè tí KAND 11 fa ni a rí (Àwòrán S4). A tún ṣàyẹ̀wò ìdáhùn ti aṣojú disopyramide 1-1 (phs1-1) tí ó ní ìmọ̀lára púpọ̀ sí KAND 11. phs1-1 ní àyípadà ojú ìwé tubulin kinase tí kì í ṣe canonical ó sì ń mú àwọn gbòǹgbò kúrú nígbà tí a bá fi disopyramide9,20 tọ́jú rẹ̀. Àwọn èso mutant phs1-1 tí a gbìn sórí agar medium tí ó ní KAND 11 ní àwọn gbòǹgbò kúkúrú tí ó jọ èyí tí a gbìn lórí disopyramid (àwòrán S5).
Ní àfikún, a kíyèsí àwọn ìṣètò microtubule mitotic, bíi àwọn agbègbè prophase, spindles, àti phragmoplasts, nínú gbòǹgbò meristem ti àwọn irugbin tí a fi KAND 11 tọ́jú. Gẹ́gẹ́ bí àwọn àkíyèsí fún CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, a rí ìdínkù pàtàkì nínú iye microtubules mitotic (Àwòrán .6c).
Láti ṣe àfihàn ìpalára ìfàjẹ̀sí KAND 11 ní ìpele ìsàlẹ̀ sẹ́ẹ̀lì, a fi KAND 11 tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìdàdúró tábà BY-2, a sì kíyèsí ìdáhùn wọn. A kọ́kọ́ fi KAND 11 kún àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí ó ń ṣàfihàn TagRFP-TUA6, èyí tí ó fi àmì sí àwọn microtubules lọ́nà fluorescent, láti ṣe àyẹ̀wò ipa KAND 11 lórí àwọn microtubules cortical. A ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n microtubule cortical nípa lílo ìṣàyẹ̀wò àwòrán, èyí tí ó ṣe àyẹ̀wò ìpín ogorun àwọn piksẹli cytoskeletal láàrín àwọn piksẹli cytoplasmic. Àwọn àbájáde ìwádìí fihàn pé lẹ́yìn ìtọ́jú pẹ̀lú 50 μM tàbí 100 μM KAND 11 fún wákàtí kan, ìwọ̀n náà dínkù sí 0.94 ± 0.74% tàbí 0.23 ± 0.28%, lẹ́sẹẹsẹ, nígbà tí ìwọ̀n àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fi DMSO tọ́jú, jẹ́ 1.61 ± 0.34% (Àwòrán 7a). Àwọn àbájáde wọ̀nyí bá àkíyèsí nínú Arabidopsis mu pé ìtọ́jú KAND 11 ń fa ìdènà àwọn microtubules cortical (Àwòrán 6b). A tún ṣe àyẹ̀wò ìlà BY-2 pẹ̀lú àwọn filaments actin tí a fi àmì GFP-ABD sí lẹ́yìn ìtọ́jú pẹ̀lú ìṣọ̀kan KAND 11 kan náà, a sì ṣàkíyèsí pé ìtọ́jú KAND 11 ba àwọn filaments actin jẹ́. Ìtọ́jú pẹ̀lú 50 μM tàbí 100 μM KAND 11 fún wákàtí kan dín ìwọ̀n filament actin kù sí 1.20 ± 0.62% tàbí 0.61 ± 0.26%, lẹ́sẹẹsẹ, nígbà tí ìwọ̀n nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fi DMSO tọ́jú jẹ́ 1.69 ± 0.51% (Àwòrán 2). 7b). Àwọn àbájáde wọ̀nyí yàtọ̀ sí àwọn ipa ti propyzamide, èyí tí kò ní ipa lórí àwọn filaments actin, àti latrunculin B, actin depolymerizer tí kò ní ipa lórí àwọn microtubules (Àwòrán SI S6). Ní àfikún, ìtọ́jú pẹ̀lú coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, tàbí KAND 11 kò ní ipa lórí àwọn microtubules nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì HeLa (SI Figure S7). Nítorí náà, a gbàgbọ́ pé ìlànà ìṣe KAND 11 yàtọ̀ sí ti àwọn ohun tí ó ń fa ìdènà cytoskeleton tí a mọ̀. Ní àfikún, àkíyèsí wa ti àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí a fi KAND 11 tọ́jú fi hàn pé ikú sẹ́ẹ̀lì bẹ̀rẹ̀ nígbà ìtọ́jú KAND 11 ó sì fihàn pé ìpín àwọn sẹ́ẹ̀lì òkú tí a fi àwọ̀ búlúù Evans kò pọ̀ sí i ní pàtàkì lẹ́yìn ìtọ́jú KAND 11 fún ìṣẹ́jú 30, nígbàtí lẹ́yìn ìtọ́jú ìṣẹ́jú 90 pẹ̀lú 50 μM tàbí 100 μM KAND, iye àwọn sẹ́ẹ̀lì òkú pọ̀ sí 43.7% tàbí 80.1%, ní ìtẹ̀léra (Àwòrán 7c). Ní àpapọ̀, àwọn dátà wọ̀nyí fihàn pé KAND 11 tí ó jẹ́ àtúnṣe ursolic acid tuntun jẹ́ ìdènà cytoskeletal kan pàtó pẹ̀lú ìlànà ìṣe tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀.
KAND ní ipa lórí àwọn microtubules cortical, actin filaments, àti bí àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 taba ṣe lè ṣiṣẹ́. (a) Fífi ojú inú wo àwọn microtubules cortical nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 ní iwájú TagRFP-TUA6. A ṣe àyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí a fi KAND 11 (50 μM tàbí 100 μM) tàbí DMSO ṣe ìtọ́jú nípa lílo confocal microscopy. A ṣírò ìwọ̀n microtubule cortical láti inú micrographs ti àwọn sẹ́ẹ̀lì aláìdádúró 25. Àwọn lẹ́tà fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn (Ìdánwò Tukey HSD, p< 0.05). Àwọ̀n ìwọ̀n = 10 µm. (b) Àwọn okùn actin cortical nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí a fi hàn níwájú GFP-ABD2. A ṣe àyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí a fi KAND 11 (50 μM tàbí 100 μM) tàbí DMSO tọ́jú nípa lílo ohun amúṣẹ́ẹ̀lì confocal. A ṣírò ìwọ̀n àwọn okùn actin cortical láti inú àwọn micrographs ti àwọn sẹ́ẹ̀lì aláìdádúró 25. Àwọn lẹ́tà fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn (Ìdánwò Tukey HSD, p< 0.05). Ìwọ̀n ìpele = 10 µm. (c) Àkíyèsí àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí ó ti kú nípa lílo àwọ̀ ewé Evans. A ṣe àyẹ̀wò àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2 tí a fi KAND 11 (50 μM tàbí 100 μM) tàbí DMSO pẹ̀lú iná mànàmáná pápá tí ó ní ìmọ́lẹ̀. n=3. Ìwọ̀n ìpele = 100 µm.
Àwárí àti lílo àwọn ọjà àdánidá tuntun ti yọrí sí ìlọsíwájú pàtàkì ní onírúurú apá ìgbésí ayé ènìyàn, títí kan ìṣègùn àti iṣẹ́ àgbẹ̀. Ìwádìí ìtàn ni a ti ṣe láti gba àwọn èròjà tó wúlò láti inú àwọn ohun àdánidá. Ní pàtàkì, a mọ̀ pé àwọn èròjà actinomycetes wúlò gẹ́gẹ́ bí àwọn èròjà apanilára fún àwọn nematodes nítorí agbára wọn láti ṣe onírúurú èròjà atẹ̀léra bíi avermectin, èròjà aṣíwájú ti ivermectin àti bleomycin àti àwọn èròjà rẹ̀, tí a lò ní ìṣègùn gẹ́gẹ́ bí ohun tí ó ń dènà àrùn jẹjẹrẹ21,22. Bákan náà, a ti ṣàwárí onírúurú èròjà apanilára láti inú àwọn èròjà actinomycetes, díẹ̀ nínú wọn ni a ti ń lò ní ti ìṣòwò1,23. Nítorí náà, ìṣàyẹ̀wò àwọn èròjà actinomycete láti ya àwọn ọjà àdánidá sọ́tọ̀ pẹ̀lú àwọn ìgbòkègbodò ẹ̀dá alààyè tí a fẹ́ ni a kà sí ọgbọ́n tí ó gbéṣẹ́. Nínú ìwádìí yìí, a ṣàwárí èròjà tuntun kan, coumamonamide, láti inú S. werraensis a sì ṣe é ní àṣeyọrí. Ursonic acid jẹ́ àárín gbùngbùn ìṣẹ̀dá ti urbenamide àti àwọn èròjà rẹ̀. Ó lè fa ìyípo gbòǹgbò tí ó ní ànímọ́, ó lè fi ìṣiṣẹ́ apanilára tí ó lágbára sí ìwọ̀nba, ó sì lè ba àwọn èròjà apanilára igi jẹ́ ní tààrà tàbí láìtaara. Sibẹsibẹ, ilana iṣẹ ti urmotonic acid le yatọ si ti awọn inhibitors microtubule ti o wa tẹlẹ, nitori KAND 11 tun n da awọn filaments actin duro o si n fa iku sẹẹli, eyiti o daba ilana ilana kan ti urmotonic acid ati awọn itọsẹ rẹ nlo lati ni ipa lori ọpọlọpọ awọn eto cytoskeletal.
Àfikún ìṣàfihàn urbenonic acid yóò ran lọ́wọ́ láti lóye bí iṣẹ́ urbenonic acid ṣe ń ṣiṣẹ́ dáadáa. Ní pàtàkì, góńgó tó tẹ̀lé ni láti ṣe àyẹ̀wò agbára ursonic acid láti so mọ́ àwọn microtubules tí ó dínkù láti mọ̀ bóyá ursonic acid àti àwọn ohun tí ó yọrí sí ń ṣiṣẹ́ tààrà lórí microtubules àti láti tú wọn jáde, tàbí bóyá iṣẹ́ wọn yóò yọrí sí ìdènà microtubule. Ní àfikún, ní irú ipò tí microtubules kò bá jẹ́ ibi tí a ń fojú sí, mímọ ibi tí iṣẹ́ àti àwọn ibi tí molikula ti ursonic acid wà lórí àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko yóò ran lọ́wọ́ láti lóye àwọn ohun-ìní àwọn ohun tí ó jọra àti àwọn ọ̀nà tí ó ṣeé ṣe láti mú iṣẹ́ herbicide sunwọ̀n síi. Ìwádìí bioactivity wa fi agbára cytotoxic àrà ọ̀tọ̀ ti ursonic acid lórí ìdàgbàsókè àwọn ewéko bíi Arabidopsis thaliana, taba àti liverwort, nígbà tí kò sí èyíkéyìí nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì E. coli tàbí HeLa tí ó ní ipa lórí. Kò sí ìpalára kankan sí àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹranko jẹ́ àǹfààní àwọn ohun tí ó yọrí sí ursonic acid tí a bá ṣe àgbékalẹ̀ wọn gẹ́gẹ́ bí herbicide fún lílò ní àwọn pápá oko tí ó ṣí sílẹ̀. Ní tòótọ́, níwọ̀n ìgbà tí microtubules jẹ́ àwọn ètò tí ó wọ́pọ̀ nínú eukaryotes, ìdíwọ́ yíyàn wọn nínú àwọn ewéko jẹ́ ohun pàtàkì fún herbicide. Fún àpẹẹrẹ, propyzamide, ohun èlò ìdènà-ẹ̀rọ microtubule tí ó so mọ́ tubulin ní tààràtà tí ó sì ń dí polymerization lọ́wọ́, ni a lò gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìtọ́jú egbòogi nítorí pé ó kéré sí àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹranko24. Ní ìyàtọ̀ sí disopyramide, àwọn benzamide tí ó jọra ní àwọn pàtó ibi-afẹ́de tí ó yàtọ̀ síra. Ní àfikún sí àwọn microtubules igi, RH-4032 tàbí benzoxamide tún ń dí àwọn microtubules ti àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹranko tàbí oomycetes lọ́wọ́, lẹ́sẹẹsẹ, a sì ń lo zalilamide gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìtọ́jú egbòogi nítorí pé ó kéré sí phytotoxicity25,26,27. Beari tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣàwárí àti àwọn ohun èlò rẹ̀ ń fi cytotoxicity tí a yàn hàn sí àwọn ewéko, ṣùgbọ́n ó yẹ kí a kíyèsí pé àwọn àtúnṣe síwájú sí i lè yí ìpele àfojúsùn wọn padà, tí ó lè pèsè àwọn ohun èlò ìtọ́jú afikún fún ìṣàkóso àwọn olú tàbí oomycetes tí ó ń fa àrùn.
Àwọn ànímọ́ àrà ọ̀tọ̀ ti urbenonic acid àti àwọn ohun tí ó yọrí sí i wúlò fún ìdàgbàsókè wọn gẹ́gẹ́ bí ohun ìtọ́jú egbòogi àti lílò gẹ́gẹ́ bí irinṣẹ́ ìwádìí. Pàtàkì cytoskeleton nínú ṣíṣàkóso ìrísí sẹ́ẹ̀lì ewéko ni a mọ̀ dáadáa. Àwọn ìwádìí ìṣáájú ti fihàn pé àwọn ewéko ti ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ọ̀nà ìṣètò microtubule cortical nípa ṣíṣàkóso ìṣiṣẹ́ microtubule láti ṣàkóso morphogenesis dáadáa. A ti ṣàwárí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn molecule tí ó jẹ́ olùṣàkóso ìṣiṣẹ́ microtubule, àti pé ìwádìí tí ó jọra ṣì ń lọ lọ́wọ́lọ́wọ́3,4,28. Òye wa lọ́wọ́lọ́wọ́ nípa ìṣiṣẹ́ microtubule nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko kò ṣàlàyé àwọn ọ̀nà ìṣètò microtubule cortical ní kíkún. Fún àpẹẹrẹ, bó tilẹ̀ jẹ́ pé disopyramide àti oryzalin lè yọ microtubules kúrò, disopyramide ń fa ìyípadà gbòǹgbò líle nígbà tí oryzalin ní ipa díẹ̀. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ìyípadà nínú tubulin, èyí tí ó ń mú kí microtubules dúró ṣinṣin, tún ń fa dextrorotation nínú àwọn gbòǹgbò, nígbà tí paclitaxel, tí ó tún ń mú kí ìṣiṣẹ́ microtubule dúró ṣinṣin, kò ṣe bẹ́ẹ̀. Nítorí náà, kíkẹ́kọ̀ọ́ àti dídá àwọn ibi-afẹ́de molikula ti ursolic acid yẹ kí ó fúnni ní òye tuntun sí ìlànà ti microtubules cortical ewéko. Bákan náà, àfiwé àwọn kẹ́míkà tí ó gbéṣẹ́ ní ìgbéga ìdàgbàsókè tí kò dára, bíi disopyramide, àti àwọn kẹ́míkà tí kò ṣiṣẹ́ dáadáa, bíi oryzalin tàbí kumamotoric acid, yóò fúnni ní àmì sí bí ìdàgbàsókè tí kò dára ṣe ń ṣẹlẹ̀ lọ́jọ́ iwájú.
Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, àtúntò cytoskeletal tí ó níí ṣe pẹ̀lú ààbò jẹ́ ọ̀nà mìíràn láti ṣàlàyé ipa ìbàjẹ́ ursonic acid. Àkóràn àkóràn tàbí fífi ohun tí ó ń fa ìfàjẹ̀sí sínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ewéko nígbà míì máa ń fa ìparun cytoskeleton àti ikú sẹ́ẹ̀lì tí ó tẹ̀lé e29. Fún àpẹẹrẹ, a ti ròyìn pé cryptoxanthin tí a ti rí láti inú oomycete ń ba microtubules àti actin filaments jẹ́ kí ó tó kú sẹ́ẹ̀lì tábà, irú èyí tí ó ṣẹlẹ̀ pẹ̀lú ìtọ́jú KAND30,31. Àwọn ìfarajọra láàárín àwọn ìdáhùn ààbò àti àwọn ìdáhùn sẹ́ẹ̀lì tí ursonic acid fà mú wa láti ronú pé wọ́n ń fa àwọn ìlànà sẹ́ẹ̀lì tí ó wọ́pọ̀, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ipa ursonic acid tí ó yára àti tí ó lágbára ju cryptoxanthin hàn gbangba. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìwádìí ti fihàn pé ìfàjẹ̀sí actin filaments ń mú ikú sẹ́ẹ̀lì tí kò ṣeé ṣe wá, èyí tí kìí sábà máa ń bá ìdènà microtubule rìn29. Ní àfikún, ó ṣì kù láti rí bóyá pathogen tàbí elicitator ń fa ìdàgbàsókè gbòǹgbò tí ó yípadà, gẹ́gẹ́ bí àwọn ohun tí ó yọrí sí ursonic acid ṣe ń ṣe. Nítorí náà, ìmọ̀ molikula tí ó so àwọn ìdáhùn ààbò àti cytoskeleton pọ̀ jẹ́ ìṣòro tí ó fani mọ́ra láti yanjú. Nípa lílo àwọn èròjà ìwúwo moleku kékeré tí ó níí ṣe pẹ̀lú ursonic acid, àti onírúurú àwọn ohun tí ó ní agbára ìṣiṣẹ́ tó yàtọ̀ síra, wọ́n lè fúnni ní àǹfààní láti fojú sí àwọn ètò sẹ́ẹ̀lì tí a kò mọ̀.
Ní gbogbogbò, àwárí àti lílo àwọn àkópọ̀ tuntun tí ó ń ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ microtubule yóò pèsè àwọn ọ̀nà alágbára láti kojú àwọn ọ̀nà ìṣiṣẹ́ molikula dídíjú tí ó wà lábẹ́ ìpinnu ìrísí sẹ́ẹ̀lì ewéko. Nínú àyíká yìí, èròjà urmotonic acid tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe, tí ó ní ipa lórí microtubules àti actin filaments tí ó sì ń fa ikú sẹ́ẹ̀lì, lè fún wa ní àǹfààní láti lóye ìsopọ̀ láàárín ìṣàkóso microtubule àti àwọn ọ̀nà míràn wọ̀nyí. Nítorí náà, ìwádìí kẹ́míkà àti ti ẹ̀dá nípa lílo urbenonic acid yóò ràn wá lọ́wọ́ láti lóye àwọn ọ̀nà ìṣàkóṣo molikula tí ó ń ṣàkóso cytoskeleton ewéko.
Fi S. werraensis MK493-CF1 sinu igo Erlenmeyer 500 mL ti a ti daru ti o ni 110 mL ti irugbin alabọde ti o ni 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto compound. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) agbado extract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ati 0.2% CaCO3 ninu omi ti a ti yọ ion kuro. (pH 7.4 ṣaaju ki a to sọ di mimọ). A fi awọn irugbin naa sinu ẹrọ gbigbọn yiyi (180 rpm) ni 27°C fun ọjọ meji. A gbin iṣelọpọ nipasẹ fermentation ti o lagbara. A gbé irúgbìn náà (7 milimita) sínú ìgò K-1 500 milimita tí ó ní 40 giramu ti ohun èlò ìṣẹ̀dá tí ó ní 15 giramu ti ọkà barle tí a tẹ̀ (MUSO Co., Ltd., Japan) àti 25 giramu ti omi tí a ti yọ ion kúrò (pH kò ṣe àtúnṣe kí a tó sọ ọ́ di aláìlera). A ṣe ìfọ́ ní 30°C nínú òkùnkùn fún ọjọ́ mẹ́rìnlá. A yọ ohun èlò ìfọ́ náà jáde pẹ̀lú 40 milimita/ìgò EtOH tí a sì fi centrifuge (1500 g, 4°C, ìṣẹ́jú 10). A yọ ohun tí ó ń yọ culture suppression (60 milimita) pẹ̀lú àdàpọ̀ 10% MeOH/EtOAc. A ti gbẹ fẹlẹfẹlẹ Organic naa labẹ titẹ ti o dinku lati gba iyokù (59.5 mg), eyiti a fi HPLC ṣe pẹlu imukuro gradient (0–10 iṣẹju: 90%) lori ọwọn ipele iyipo kan (SHSEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × gigun 250 mm) H2O/CH3CN, iṣẹju 10–35: 90% H2O/CH3CN si 70% H2O/CH3CN (gradient), iṣẹju 35–45: 90% H2O/EtOH, iṣẹju 45–155: 90% H2O/EtOH si 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 iṣẹju: 100% EtOH) ni oṣuwọn sisan ti 1.5 milimita/min, a ya coumamonamide (1, 36.0 mg) sọtọ bi lulú amorphous funfun kan.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ iye ti a ṣírò: 141.0659, iye ti a wọn: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
A gba irugbin Columbia (Col-0) lati Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) pẹlu igbanilaaye fun lilo iwadii. A gbin irugbin Col-0 ati itọju labẹ awọn ipo yàrá wa ati lilo bi awọn eweko Arabidopsis iru igbo. A fi awọn irugbin Arabidopsis ṣe itọju dada a si gbin wọn sinu alabọde Murashige ati Skoog ti o ni agbara idaji ti o ni 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) ati 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ni 23 °C ati ina ti o duro nigbagbogbo. T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) pese awọn irugbin ti mutant phs1-1.
T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ló pèsè irúgbìn SR-1, wọ́n sì lò ó gẹ́gẹ́ bí ewéko tábà onígbó. A fi àwọn irúgbìn tábà sí ojú ilẹ̀, a sì fi wọ́n sínú omi tó mọ́ fún alẹ́ mẹ́ta láti mú kí ìbísí pọ̀ sí i, lẹ́yìn náà a fi wọ́n sínú omi tó lágbára tó ní 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, àti 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. àti Skoog medium) pẹ̀lú pH 5.7, a sì fi wọ́n sínú 23°C lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ tó ń tàn kálẹ̀.
T. Kohchi (Yunifásítì Kyoto) ló pèsè Tak-1, wọ́n sì lò ó gẹ́gẹ́ bí ẹ̀rọ ìwádìí tó wọ́pọ̀ fún ìwádìí liverwort. A gba Gemma láti inú àwọn ewéko tí a ti gbin tí a sì fi sterilized bò ó, lẹ́yìn náà a fi sí orí Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) tí ó ní 1% sucrose àti 0.3% gellan gum, a sì fi sínú iná ní 23°C lábẹ́ ìmọ́lẹ̀ tó ń tẹ̀síwájú.
S. Hasezawa (Yunifásítì Tokyo) ló pèsè àwọn sẹ́ẹ̀lì tábà BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2). A fi ìdapọ̀ sẹ́ẹ̀lì BY-2 pò ní ìlọ́po 95 nínú Linsmeier àti Skoog tí a ti yípadà, a sì fi 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 kún un lọ́sọ̀ọ̀sẹ̀. A da ìdàpọ̀ sẹ́ẹ̀lì náà pọ̀ mọ́ rotary shaker ní 130 rpm ní 27°C nínú òkùnkùn. Fọ àwọn sẹ́ẹ̀lì pẹ̀lú ìlọ́po 10 iwọn ti fresh medium kí o sì tún padà sínú fresh medium kan náà. A ṣẹ̀dá àwọn ìlà sẹ́ẹ̀lì transgenic BY-2 tí ó ń fi àmì microtubule TagRFP-TUA6 hàn ní ìdúróṣinṣin tàbí àmì actin filament GFP-ABD2 lábẹ́ cauliflower mosaic virus 35S promoter gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé33,34,35. A lè tọ́jú àwọn ìlà sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí kí a sì mú wọn ṣiṣẹpọ nípa lílo àwọn ìlànà tí ó jọ àwọn tí a lò fún ìlà sẹ́ẹ̀lì BY-2 àtilẹ̀wá.
A gbin awọn sẹẹli HeLa sinu alabọde Eagle ti a ti yipada si Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) ti a fi kun serum malu oyun 10%, penicillin 1.2 U/ml, ati streptomycin 1.2 μg/ml ninu incubator 37°C pẹlu 5% CO2.
Gbogbo àwọn ìdánwò tí a ṣàlàyé nínú ìwé àfọwọ́kọ yìí ni a ṣe ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìlànà àti ìlànà ààbò ẹ̀dá ará Japan.
A tú àwọn èròjà inú dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) gẹ́gẹ́ bí omi ìpèsè, a sì fi wọ́n sínú MS medium fún Arabidopsis àti taba tàbí Gamborg B5 medium fún liverwort. Fún ìdánwò ìdínà ìdàgbàsókè gbòǹgbò, a gbìn ju irúgbìn 10 lọ fún àwo kọ̀ọ̀kan lórí agar medium tí ó ní àwọn èròjà tí a tọ́ka sí tàbí DMSO. A fi àwọn irúgbìn sínú yàrá ìdàgbàsókè fún ọjọ́ méje. A ya àwòrán àwọn èso náà, a sì wọn gígùn gbòǹgbò náà. Fún ìdánwò ìdàgbàsókè Arabidopsis, a gbìn irúgbìn 48 fún àwo kọ̀ọ̀kan lórí agar medium tí ó ní 200 μM compound tàbí DMSO. A gbìn irúgbìn Arabidopsis nínú yàrá ìdàgbàsókè, a sì ka iye àwọn èso tí ó gbó lẹ́yìn ìdàgbàsókè (dag). Fún ìdánwò ìdàgbàsókè tábà, a gbìn irúgbìn 24 fún àwo kọ̀ọ̀kan lórí agar medium tí ó ní 200 μM KAND tàbí DMSO. A gbìn irúgbìn tábà nínú yàrá ìdàgbàsókè, a sì ka iye àwọn èso tí ó gbó lẹ́yìn ọjọ́ 14. Fún àyẹ̀wò ìdíwọ́ ìdàgbàsókè liverwort, a fi àwọn ọmọ inú 9 láti inú àwo kọ̀ọ̀kan sí orí agar medium tí ó ní ìwọ̀n KAND tàbí DMSO tí a fihàn, a sì fi sínú yàrá ìdàgbàsókè fún ọjọ́ mẹ́rìnlá.
Lo àwọn irugbin tí a fi 5 mg/ml propidium iodide (PI) ṣe àwọ̀ láti fojú inú wo ìṣètò root meristem. A ṣe àkíyèsí àwọn àmì PI nípa lílo ohun èlò ìwádìí laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
A ṣe àwọ̀ histochemical ti awọn gbòǹgbò pẹlu β-glucuronidase (GUS) gẹ́gẹ́ bí ìlànà tí Malami àti Benfey36 ṣàlàyé. A fi acetone 90% kún àwọn irugbin náà ní alẹ́, a fi 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid kùn wọ́n nínú GUS buffer fún wákàtí kan, a sì fi wọ́n sínú omi chloraldehyde tí a fi omi bò. (8 g chloral hydrate, 2 ml omi àti glycerol 1 ml) a sì ṣe àkíyèsí wọn nípa lílo microscope Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
A wọn awọn igun gbongbo lori awọn irugbin ọjọ meje ti a gbin lori awọn awo ti a gbe ni inaro. Wọn igun gbongbo lati itọsọna ti vector walẹ bi a ti ṣalaye ni igbesẹ 6.
A ṣe akiyesi eto awọn microtubules cortical gẹgẹ bi a ti ṣalaye, pẹlu awọn iyipada kekere si ilana 37. Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ati Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ni a lo bi awọn antibodies akọkọ ati keji ni 1:1000 ati 1:100 dilutions, lẹsẹsẹ. A gba awọn aworan fluorescence nipa lilo TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems). Gba awọn aworan Z-stack ki o ṣẹda awọn asọtẹlẹ kikankikan ti o pọju gẹgẹbi awọn ilana olupese.
A ṣe àyẹ̀wò ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì HeLa nípa lílo Ohun èlò ìkàsí sẹ́ẹ̀lì 8 (Dojindo) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè.
A ṣe àyẹ̀wò ìdàgbàsókè E. coli DH5α nípa wíwọ̀n ìwúwo sẹ́ẹ̀lì nínú àṣà nípa lílo spectrophotometer ní 600 nm (OD600).
A ṣe akiyesi ìṣètò Cytoskeletal nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì transgenic BY-2 nípa lílo microscope fluorescence tí a fi ẹ̀rọ ìwòran confocal CSU-X1 (Yokogawa) àti kámẹ́rà sCMOS (Zyla, Andor Technology) ṣe àyẹ̀wò ìwọ̀n Cytoskeletal nípa lílo àyẹ̀wò àwòrán, èyí tí ó ṣe ìṣírò ìpín ogorun àwọn piksẹli cytoskeletal láàrín àwọn piksẹli cytoplasmic nínú àwọn àwòrán confocal nípa lílo software ImageJ gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé38,39.
Láti ṣàwárí ikú sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì BY-2, a fi 0.05% Evans blue sí ìpín kan nínú ìdábùú sẹ́ẹ̀lì náà fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá ní iwọ̀n otútù yàrá. Àwọ̀ ewé Evans blue tí ó yan lára àwọn sẹ́ẹ̀lì òkú sinmi lórí ìtújáde àwọ̀ náà láti inú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ṣeé gbé kiri nípasẹ̀ awọ ara plasma tí ó wà nílẹ̀40. A rí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ní àwọ̀ pẹ̀lú mànàmáná pápá tí ó ní ìmọ́lẹ̀ (BX53, Olympus).
A gbin awọn sẹẹli HeLa sinu DMEM pẹlu afikun 10% FBS ninu incubator ti o tutu ni 37°C ati 5% CO2. A fi 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), tabi 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) tọju awọn sẹẹli fun wakati mẹfa ni 37°C. A fi MetOH ṣatunṣe awọn sẹẹli fun iṣẹju mẹwa ati lẹhinna pẹlu acetate fun iṣẹju marun ni iwọn otutu yara. A fi β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ti a fi omi ṣan awọn sẹẹli ti o wa titi sinu 0.5% BSA/PBS fun wakati meji, a fi TBST wẹ̀ wọn ni igba mẹta, lẹhinna a fi Alexa Fluor ewúrẹ́ antibody sinu wọn. 488 wakati kan. – Asin IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) àti 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tí a ti pò mọ́ 0.5% BSA/PBS. Lẹ́yìn tí a ti fi TBST wẹ̀ ẹ́ nígbà mẹ́ta, a rí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ní àbàwọ́n lórí amúsọ̀rọ̀pọ̀ oní-nọ́ńbà Nikon Eclipse Ti-E. A ya àwòrán náà pẹ̀lú kámẹ́rà Hamamatsu ORCA-R2 CCD tí ó tutù nípa lílo sọ́fítíwọ́ọ̀kì MetaMorph (Àwọn Ẹ̀rọ Molecular).
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Oṣù Kẹfà-17-2024