Ìdàgbàsókè apical meristem (SAM) ṣe pàtàkì fún ìṣètò igi.gibberellins(GAs) ń kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣètò ìdàgbàsókè ewéko, ṣùgbọ́n ipa wọn nínú SAM kò tíì yé wa dáadáa. Níbí, a ṣe àgbékalẹ̀ biosensor ti GA signaling nípa ṣíṣe ẹ̀rọ DELLA protein láti dín iṣẹ́ ìlànà pàtàkì rẹ̀ kù nínú ìdáhùn ìkọ̀wé GA nígbàtí ó ń pa ìbàjẹ́ rẹ̀ mọ́ nígbàtí a bá ń dá GA mọ̀. A fihàn pé biosensor tí ó dá lórí ìbàjẹ́ yìí ń ṣàkọsílẹ̀ àwọn ìyípadà nínú àwọn ipele GA àti sensọ sẹ́ẹ̀lì nígbà ìdàgbàsókè. A lo biosensor yìí láti ṣe àfihàn iṣẹ́ àmì GA nínú SAM. A fihàn pé àwọn àmì GA gíga wà ní pàtàkì nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó wà láàárín organ primordia, èyí tí ó jẹ́ àwọn ohun tí ó ṣáájú sí àwọn sẹ́ẹ̀lì internode. Nípa lílo àwọn ọ̀nà jíjẹ àti pípadánù iṣẹ́, a tún fihàn pé GA ń ṣe àkóso ìtọ́sọ́nà ti prótéèjì ìpín sẹ́ẹ̀lì, ó ń ṣe àgbékalẹ̀ ìṣètò sẹ́ẹ̀lì canonical ti àwọn internodes, nípa bẹ́ẹ̀ a ń gbé ìṣètò internode lárugẹ nínú SAM.
Àwòrán meristem (SAM) tí ó wà ní orí òkè ìgbó, ní àwọn sẹ́ẹ̀lì ìgbó tí ìṣiṣẹ́ wọn ń mú àwọn ẹ̀yà ara àti àwọn ihò ìgbó jáde ní ọ̀nà onípele àti ìyípadà ní gbogbo ìgbésí ayé ewéko náà. Ọ̀kọ̀ọ̀kan àwọn ẹ̀yà tí ó ń tún ara wọn ṣe, tàbí àwọn ihò ewéko, ní àwọn internodes àti àwọn ẹ̀yà ara ẹ̀gbẹ́ ní àwọn ihò, àti àwọn meristems axillary nínú àwọn axils ewéko1. Ìdàgbàsókè àti ìṣètò àwọn ihò ewéko ń yípadà nígbà ìdàgbàsókè. Nínú Arabidopsis, ìdàgbàsókè internodal ni a dínkù ní àkókò ìpele ìgbó, àti àwọn meristems axillary ń dúró ní àwọn axils ti àwọn ewé rosette. Nígbà ìyípadà sí ìpele ìgbó, SAM di meristem ìpìlẹ̀, tí ó ń mú àwọn internodes gígùn àti àwọn èso axillary jáde, àwọn ẹ̀ka igi ní àwọn axils ti àwọn ewé cauline, àti lẹ́yìn náà, àwọn òdòdó tí kò ní ewé2. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti ṣe ìlọsíwájú pàtàkì ní òye àwọn ọ̀nà tí ó ń ṣàkóso ìbẹ̀rẹ̀ ewé, òdòdó, àti àwọn ẹ̀ka igi, a kò mọ̀ púpọ̀ nípa bí internodes ṣe ń dìde.
Lílóye ìpínkiri aaye ti awọn GA yoo ran lọwọ lati ni oye daradara awọn iṣẹ ti awọn homonu wọnyi ni awọn ara oriṣiriṣi ati ni awọn ipele idagbasoke oriṣiriṣi. Wiwo ti ibajẹ ti idapọ RGA-GFP ti a fihan labẹ iṣẹ ti olupolowo tirẹ pese alaye pataki lori ilana ti apapọ awọn ipele GA ni awọn roots15,16. Sibẹsibẹ, ikosile RGA yatọ si kọja awọn tissues17 ati pe GA18 ni iṣakoso. Nitorinaa, ikosile iyatọ ti olupolowo RGA le ja si ilana fluorescence ti a ṣe akiyesi pẹlu RGA-GFP ati nitorinaa ọna yii kii ṣe iṣiro. Laipẹ diẹ, GA19,20 ti a fi aami si bioactive fluorescein (Fl) ṣafihan ikojọpọ ti GA ninu endocortex gbongbo ati ilana ti awọn ipele sẹẹli rẹ nipasẹ gbigbe GA. Laipẹ yii, sensọ GA FRET nlsGPS1 fihan pe awọn ipele GA ni ibatan pẹlu gigun sẹẹli ninu awọn gbongbo, awọn okun, ati awọn hypocotyls21 ti o dagba dudu. Sibẹsibẹ, bi a ti rii, ifọkansi GA kii ṣe paramita nikan ti o n ṣakoso iṣẹ ifihan GA, bi o ṣe da lori awọn ilana sensọ ti o nira. Níbí, tí a gbé e karí òye wa nípa àwọn ipa ọ̀nà ìfàmìsí DELLA àti GA, a ń ròyìn ìdàgbàsókè àti ìṣàpẹẹrẹ biosensor ratiometric tí ó dá lórí ìbàjẹ́ fún ìfàmìsí GA. Láti ṣe àgbékalẹ̀ biosensor quantitative yìí, a lo RGA onímọ̀lára GA-GA kan tí a so pọ̀ mọ́ protein fluorescent kan tí a sì fihàn ní gbogbo ibi nínú àwọn àsopọ, àti protein fluorescent GA tí kò ní ìmọ̀lára. A fihàn pé àwọn ìdàpọ̀ protein RGA onímọ̀lára kò dí ìfàmìsí GA onímọ̀lára lọ́wọ́ nígbà tí a bá fihàn ní gbogbo ibi, àti pé biosensor yìí le ṣe ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ ìfàmìsí tí ó jẹyọ láti inú ìtẹ̀síwájú GA àti ìṣiṣẹ́ àmì GA láti ọwọ́ ẹ̀rọ ìfàmìsí pẹ̀lú ìpinnu spatiotemporal gíga. A lo biosensor yìí láti ṣe àfihàn ìpínkiri spatiotemporal ti iṣẹ́ ìfàmìsí GA àti láti ṣe ìwọ̀n bí GA ṣe ń ṣe ìṣàkóso ìwà sẹ́ẹ̀lì nínú epidermis SAM. A fihàn pé GA ń ṣe àkóso ìtọ́sọ́nà ìpínkiri ti àwọn sẹ́ẹ̀lì SAM tí ó wà láàrín organ primordia, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣàlàyé ìṣètò sẹ́ẹ̀lì canonical ti internode.
Níkẹyìn, a béèrè bóyá qmRGA lè ròyìn àwọn ìyípadà nínú àwọn ipele GA endogenous nípa lílo hypocotyls tó ń dàgbà. A ti fihàn tẹ́lẹ̀ pé nitrate ń ru ìdàgbàsókè sókè nípa mímú kí ìṣẹ̀dá GA pọ̀ sí i àti, ní ọ̀nà kan náà, ìbàjẹ́ DELLA34. Nítorí náà, a ṣe àkíyèsí pé gígùn hypocotyl nínú àwọn irugbin pUBQ10::qmRGA tí a gbìn lábẹ́ ìpèsè nitrate púpọ̀ (10 mM NO3−) gùn ju ti àwọn irugbin tó gbìn lábẹ́ àwọn ipò àìní nitrate lọ (Àfikún Àwòrán 6a). Ní ìbámu pẹ̀lú ìdáhùn ìdàgbàsókè, àwọn àmì GA ga jù nínú àwọn hypocotyls ti àwọn irugbin tó gbìn lábẹ́ àwọn ipò 10 mM NO3− ju ti àwọn irugbin tó gbìn nígbà tí kò ní nitrate (Àfikún Àwòrán 6b, c). Nítorí náà, qmRGA tún ń jẹ́ kí a ṣe àkíyèsí àwọn ìyípadà nínú àmì GA tí àwọn ìyípadà inú nínú ìfọkànsí GA fà.
Láti mọ̀ bóyá iṣẹ́ àmì GA tí qmRGA ṣàwárí da lórí ìfọkànsí GA àti ìríran GA, gẹ́gẹ́ bí a ṣe retí, ní ìbámu pẹ̀lú ìrísí sensọ, a ṣe àyẹ̀wò ìfarahàn àwọn olugba GID1 mẹ́ta nínú àwọn àsopọ̀ ewéko àti ìbísí. Nínú àwọn irugbin, ìlà oníròyìn GID1-GUS fihàn pé GID1a àti c ní ìrísí gíga nínú cotyledons (Àwòrán 3a–c). Ní àfikún, gbogbo àwọn olugba mẹ́ta ni a fihàn nínú ewé, gbòǹgbò primordia ní ẹ̀gbẹ́, àwọn ìpẹ́ gbòǹgbò (àyàfi ìbòrí gbòǹgbò ti GID1b), àti ètò iṣan ara (Àwòrán 3a–c). Nínú ìtànṣán SAM, a ṣàwárí àwọn àmì GUS fún GID1b àti 1c nìkan (Àwòrán Àfikún 7a–c). In situ hybridization jẹ́rìí sí àwọn àpẹẹrẹ ìfarahàn wọ̀nyí ó sì tún fihàn pé GID1c ní ìpele kékeré nínú SAM, nígbà tí GID1b fi ìfarahàn gíga hàn ní ẹ̀gbẹ́ SAM (Àwòrán Àfikún 7d–l). Ìdàpọ̀ ìtumọ̀ pGID1b::2xmTQ2-GID1b tún fi hàn pé a ti ṣe àkójọpọ̀ ìṣàfihàn GID1b, láti ìṣàfihàn kékeré tàbí àìsí ìṣàfihàn ní àárín SAM sí ìṣàfihàn gíga ní àwọn ààlà ẹ̀yà ara (Àfikún Àwòrán 7m). Nítorí náà, àwọn olugba GID1 kò pín káàkiri àti láàárín àwọn àsopọ̀ ara. Nínú àwọn ìwádìí tó tẹ̀lé e, a tún kíyèsí pé ìṣàfihàn púpọ̀ ti GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) mú kí ìfàmọ́ra qmRGA pọ̀ sí i nínú àwọn hypocotyls sí ìlò GA òde (Àwòrán 3d, e). Ní ìyàtọ̀ sí èyí, ìfàmọ́ra fluorescence tí a wọ̀n nípasẹ̀ qd17mRGA nínú hypocotyl kò ní ìmọ̀lára sí ìtọ́jú GA3 (Àwòrán 3f, g). Fún àwọn àyẹ̀wò méjèèjì, a fi àwọn ìfọ́síwájú gíga ti GA (100 μM GA3) tọ́jú àwọn irugbin láti ṣe àyẹ̀wò ìṣe iyara ti sensọ̀ náà, níbi tí agbára láti so mọ́ olugba GID1 ti pọ̀ sí i tàbí tí ó sọnù. Papọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí jẹ́rìí sí i pé ohun èlò ìṣiṣẹ́ qmRGA ń ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìṣiṣẹ́ GA àti GA, ó sì dámọ̀ràn pé ìfarahàn ìyàtọ̀ ti ohun èlò ìṣiṣẹ́ GID1 lè ṣe àtúnṣe ìtújáde ohun èlò ìṣiṣẹ́ náà ní pàtàkì.
Títí di òní, ìpínkiri àwọn àmì GA nínú SAM kò tíì yé wa. Nítorí náà, a lo àwọn ohun ọ̀gbìn tí ń fihàn qmRGA àti pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 láti ṣírò àwọn àwòrán onípele gíga ti iṣẹ́ ìfàmì GA, tí ó dojúkọ ìpele L1 (epidermis; Àwòrán 4a, b, wo Àwọn Ọ̀nà àti Àwọn Ọ̀nà Àfikún), nítorí pé L1 ń kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣàkóso ìdàgbàsókè SAM36. Níbí, ìfihàn pCLV3::mCherry-NLS pèsè ojú ìtọ́kasí onípele tí ó wà fún ṣíṣàyẹ̀wò ìpínkiri spatiotemporal ti iṣẹ́ ìfàmì GA37. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a kà GA sí pàtàkì fún ìdàgbàsókè ẹ̀yà ara ní ẹ̀gbẹ́4, a ṣàkíyèsí pé àwọn àmì GA kéré nínú primordium ododo (P) bẹ̀rẹ̀ láti ìpele P3 (Àwòrán 4a, b), nígbà tí àwọn primordium P1 àti P2 ọ̀dọ́ ní ìṣiṣẹ́ díẹ̀ tí ó jọ ti agbègbè àárín (Àwòrán 4a, b). A rí iṣẹ́ àmì GA tó ga jùlọ ní àwọn ààlà organ primordium, tó bẹ̀rẹ̀ láti P1/P2 (ní ẹ̀gbẹ́ ààlà) tó sì dé òkè ní P4, àti ní gbogbo àwọn sẹ́ẹ̀lì agbègbè tó wà láàrín primordia (Àwòrán 4a, b àti Àwòrán Àfikún 8a, b). A rí iṣẹ́ àmì GA tó ga yìí kì í ṣe nínú epidermis nìkan, ṣùgbọ́n a tún rí i nínú àwọn fẹ́lẹ́ L2 àti òkè L3 (Àwòrán Àfikún 8b). Àpẹẹrẹ àwọn àmì GA tó wà nínú SAM nípa lílo qmRGA náà kò yí padà bí àkókò ti ń lọ (Àwòrán Àfikún 8c–f, k). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a dín ìṣètò qd17mRGA kù ní ìpele SAM ti àwọn igi T3 láti àwọn ìlà márùn-ún aláìdádúró tí a ṣe àpèjúwe ní kíkún, a lè ṣe àtúpalẹ̀ àwọn àpẹẹrẹ ìmọ́lẹ̀ tí a rí pẹ̀lú ìṣètò pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Àwòrán Àfikún 8g–j, l). Nínú ìlà ìṣàkóso yìí, àwọn ìyípadà díẹ̀ ni a rí nínú ìpíndọ́gba fluorescence nínú SAM, ṣùgbọ́n ní àárín gbùngbùn SAM a rí ìdínkù tí ó hàn gbangba tí a kò retí nínú VENUS tí ó níí ṣe pẹ̀lú TagBFP. Èyí jẹ́rìí sí i pé ìlànà àmì tí qmRGA ṣàkíyèsí ṣàfihàn ìbàjẹ́ tí ó gbára lé GA ti mRGA-VENUS, ṣùgbọ́n ó tún fihàn pé qmRGA lè ṣe àkíyèsí iṣẹ́ àmì GA ní àárín gbùngbùn meristem. Ní àkótán, àwọn àbájáde wa fi àpẹẹrẹ àmì GA hàn tí ó ṣe àfihàn pípín primordia ní pàtàkì. Pínpín agbègbè inter-primordial (IPR) yìí jẹ́ nítorí ìdásílẹ̀ díẹ̀díẹ̀ ti iṣẹ́ àmì GA gíga láàárín primordium tí ń dàgbàsókè àti agbègbè àárín, nígbàtí ní àkókò kan náà iṣẹ́ àmì GA nínú primordium ń dínkù (Àwòrán 4c, d).
Pínpín àwọn olugba GID1b àti GID1c (wo òkè) fihàn pé ìfarahàn ìyàtọ̀ ti àwọn olugba GA ń ran lọ́wọ́ láti ṣe àgbékalẹ̀ àpẹẹrẹ iṣẹ́ ìfàmì GA nínú SAM. A ń ṣe kàyéfì bóyá ìkójọpọ̀ ìyàtọ̀ ti GA lè ní ipa nínú rẹ̀. Láti ṣe ìwádìí lórí ìṣeéṣe yìí, a lo nlsGPS1 GA FRET sensor21. A rí ìpele ìṣiṣẹ́ tí ó pọ̀ sí i nínú SAM ti nlsGPS1 tí a tọ́jú pẹ̀lú 10 μM GA4+7 fún ìṣẹ́jú 100 (Àfikún Àwòrán 9a–e), tí ó fihàn pé nlsGPS1 ń dáhùn sí àwọn ìyípadà nínú ìfojúsùn GA nínú SAM, gẹ́gẹ́ bí ó ti ṣe ní roots21. Pínpín àyíká ti ìpele ìṣiṣẹ́ nlsGPS1 fi àwọn ipele GA tí ó kéré ní ìpele òde SAM hàn, ṣùgbọ́n ó fihàn pé wọ́n ga ní àárín àti ní ààlà SAM (Àwòrán 4e àti Àfikún Àwòrán 9a,c). Èyí fihàn pé GA tún pín nínú SAM pẹ̀lú àpẹẹrẹ ààyè tí ó jọ èyí tí qmRGA fi hàn. Gẹ́gẹ́ bí ọ̀nà àfikún, a tún ṣe ìtọ́jú SAM pẹ̀lú fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) tàbí Fl nìkan gẹ́gẹ́ bí ìdarí odi. A pín àmì Fl káàkiri SAM, títí kan agbègbè àárín àti primordium, bó tilẹ̀ jẹ́ pé agbára díẹ̀ ni (Àwòrán 4j àti Àfikún Àwòrán 10d). Ní ìyàtọ̀ sí èyí, gbogbo GA-Fl mẹ́ta kó jọ ní pàtó láàárín àwọn ààlà primordium àti sí onírúurú ìwọ̀n ní ìyókù IPR, pẹ̀lú GA7-Fl tí ó kó jọ ní agbègbè tí ó tóbi jùlọ nínú IPR (Àwòrán 4k àti Àfikún Àwòrán 10a,b). Ìwọ̀n agbára fluorescence fihàn pé ìpíndọ́gba agbára IPR sí ti kìí ṣe IPR ga jù nínú SAM tí a tọ́jú GA-Fl ní ìfiwéra pẹ̀lú SAM tí a tọ́jú Fl (Àwòrán 4l àti Àfikún Àwòrán 10c). Papọ̀, àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé GA wà ní àwọn ìfọ́pọ̀ gíga nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR tí ó súnmọ́ ààlà ẹ̀yà ara. Èyí fihàn pé àpẹẹrẹ ìṣiṣẹ́ ìfàmì SAM GA jẹ́yọ láti inú ìfarahàn ìyàtọ̀ ti àwọn olugba GA àti ìkójọpọ̀ ìyàtọ̀ ti GA nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR nítòsí àwọn ààlà ẹ̀yà ara. Nítorí náà, ìwádìí wa fi àpẹẹrẹ ìfàmì GA hàn láìròtẹ́lẹ̀, pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ tí ó dínkù ní àárín àti primordium ti SAM àti ìṣiṣẹ́ tí ó ga jùlọ ní IPR ní agbègbè agbègbè.
Láti lóye ipa iṣẹ́ àmì GA tó yàtọ̀ nínú SAM, a ṣe àgbéyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ láàárín iṣẹ́ àmì GA, ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì, àti pípín sẹ́ẹ̀lì nípa lílo àwòrán àkókò-ìdádúró gidi ti SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Nítorí ipa GA nínú ìlànà ìdàgbàsókè, a retí ìbáṣepọ̀ rere pẹ̀lú àwọn pàrámítà ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì. Nítorí náà, a kọ́kọ́ fi àwọn párámítà ìṣiṣẹ́ àmì GA wé pẹ̀lú àwọn párámítà ìyípadà sẹ́ẹ̀lì (gẹ́gẹ́ bí aṣojú fún agbára ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì fún sẹ́ẹ̀lì kan àti fún àwọn párámítà ọmọbìnrin ní ìpínpín) àti pẹ̀lú àwọn párámítà anisotropy ìdàgbàsókè, èyí tí ó ń wọn ìtọ́sọ́nà ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì (tí a tún lò níbí fún sẹ́ẹ̀lì kan àti fún àwọn párámítà ọmọbìnrin ní ìpínpín; Àwòrán 5a,b, wo Àwọn Ọ̀nà àti Àwọn Ọ̀nà Àfikún). Àwọn párámítà wa ti ìwọ̀n ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì SAM bá àwọn àkíyèsí ìṣáájú mu38,39, pẹ̀lú àwọn ìwọ̀n ìdàgbàsókè tó kéré ní ààlà àti àwọn ìwọ̀n ìdàgbàsókè tó pọ̀ jùlọ nínú àwọn òdòdó tó ń dàgbàsókè (Àwòrán 5a). Ìṣàyẹ̀wò èròjà pàtàkì (PCA) fihàn pé ìṣiṣẹ́ àmì GA ní ìbáṣepọ̀ odi pẹ̀lú agbára ìdàgbàsókè dáda sẹ́ẹ̀lì (Àwòrán 5c). A tún fihàn pé àwọn àáké pàtàkì ti ìyàtọ̀, pẹ̀lú ìtẹ̀síwájú àmì GA àti agbára ìdàgbàsókè, jẹ́ ti ìtọ́sọ́nà tí a pinnu nípasẹ̀ ìfihàn CLV3 gíga, tí ó fìdí múlẹ̀ pé a yọ àwọn sẹ́ẹ̀lì kúrò ní àárín SAM nínú àwọn àyẹ̀wò tó kù. Ìṣàyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ Spearman jẹ́rìí sí àwọn àbájáde PCA (Àwòrán 5d), èyí tí ó fihàn pé àwọn àmì GA tó ga jùlọ nínú IPR kò yọrí sí ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì tó ga jù. Síbẹ̀síbẹ̀, ìṣàyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ fi ìbáṣepọ̀ rere díẹ̀ hàn láàárín iṣẹ́ àmì GA àti anisotropy ìdàgbàsókè (Àwòrán 5c, d), èyí tí ó fihàn pé àmì GA tó ga jùlọ nínú IPR ní ipa lórí ìtọ́sọ́nà ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì àti bóyá ipò pípín sẹ́ẹ̀lì.
a, b Àwọn àwòrán ooru ti ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀ (a) àti anisotropy ìdàgbàsókè (b) nínú SAM ní àròpín lórí àwọn ewéko aláìdádúró méje (tí a lò gẹ́gẹ́ bí àwọn aṣojú fún agbára àti ìtọ́sọ́nà ìfẹ̀sí sẹ́ẹ̀lì, lẹ́sẹẹsẹ). c Ìṣàyẹ̀wò PCA ní àwọn oníyípadà wọ̀nyí: àmì GA, agbára ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀, anisotropy ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀, àti ìfihàn CLV3. Apá PCA 1 ní ìbáṣepọ̀ odi pẹ̀lú agbára ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀ àti ìbáṣepọ̀ rere pẹ̀lú àmì GA. Apá PCA 2 ní ìbáṣepọ̀ rere pẹ̀lú anisotropy ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀ àti ìbáṣepọ̀ odi pẹ̀lú ìfihàn CLV3. Ìpíndọ́gba dúró fún ìyàtọ̀ tí a ṣàlàyé nípasẹ̀ ẹ̀yà kọ̀ọ̀kan. d Ìṣàyẹ̀wò ìbáṣepọ̀ Spearman láàrín àmì GA, agbára ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀, àti anisotropy ìdàgbàsókè ojú ilẹ̀ ní ìwọ̀n àsopọ láìsí CZ. Nọ́mbà tí ó wà ní ọ̀tún ni iye Spearman rho láàrín àwọn oníyípadà méjì. Àwọn àmì ìràwọ̀ fihàn àwọn ọ̀ràn níbi tí ìbáṣepọ̀/odi jẹ́ pàtàkì gidigidi. e 3D ìwòran àwọn sẹ́ẹ̀lì Col-0 SAM L1 nípasẹ̀ confocal microscopy. Àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun tí a ṣẹ̀dá nínú SAM (ṣùgbọ́n kìí ṣe primordium) ní wákàtí 10 ni a kùn ní ìbámu pẹ̀lú àwọn iye igun wọn. A fi ọ̀pá àwọ̀ náà hàn ní igun ọ̀tún ìsàlẹ̀. Àwòrán 3D tó báramu náà hàn ní àkókò 0 h. A tún ṣe àyẹ̀wò náà lẹ́ẹ̀mejì pẹ̀lú àwọn àbájáde tó jọra. f Àwọn àwòrán àpótí ń fi àwọn ìwọ̀n ìpín sẹ́ẹ̀lì hàn nínú IPR àti àwọn ohun ọ̀gbìn tí kìí ṣe IPR Col-0 SAM (n = 10 àwọn ohun ọ̀gbìn aláìdádúró). Ìlà àárín náà fi àárín hàn, àwọn ààlà àpótí sì ń fi àwọn ìpín 25 àti 75th hàn. Àwọn ìrun fi àwọn ìwọ̀n tó kéré jùlọ àti èyí tó pọ̀ jùlọ tí a pinnu pẹ̀lú sọ́fítíwọ́ọ̀tì R hàn. A gba àwọn ìwọ̀n P pẹ̀lú ìdánwò t-ìrù méjì ti Welch. g, h Àwòrán skematic tó ń fi (g) bí a ṣe lè wọn igun ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun (magenta) hàn ní ìbámu pẹ̀lú ìtọ́sọ́nà radial láti àárín SAM (ìlà funfun tí ó ní àmì) (àwọn ìwọ̀n igun tó lágbára nìkan ni a gbé yẹ̀wò, ìyẹn ni pé, 0–90°), àti (h) àwọn ìtọ́sọ́nà àyíká/ìta àti radial láàrín meristem. i Àwọn histogram ìgbìmọ̀ ìpín sẹ́ẹ̀lì kọjá SAM (bulu dúdú), IPR (bulu ààbọ̀), àti èyí tí kìí ṣe IPR (bulu dúdú), ní ìtẹ̀léra. A gba awọn iye P nipasẹ idanwo Kolmogorov-Smirnov onigun meji. A tun ṣe idanwo naa lẹẹmeji pẹlu awọn abajade kanna. j Awọn histogram igbohunsafẹfẹ ti itọsọna iyipo pipin sẹẹli ti IPR ni ayika P3 (alawọ ewe fẹẹrẹ), P4 (alawọ ewe alabọde), ati P5 (alawọ ewe dudu), lẹsẹsẹ. Awọn iye P ni a gba nipasẹ idanwo Kolmogorov-Smirnov onigun meji. A tun ṣe idanwo naa lẹẹmeji pẹlu awọn abajade kanna.
Nítorí náà, a tún ṣe ìwádìí ìbáṣepọ̀ láàrín àmì GA àti iṣẹ́ ìpín sẹ́ẹ̀lì nípa dídá àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun tí a ṣẹ̀dá nígbà ìwádìí náà (Àwòrán 5e). Ọ̀nà yìí gbà wá láyè láti wọn ìgbọ̀ọ̀ àti ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì. Lọ́nà ìyanu, a rí i pé ìgbọ̀ọ̀ àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR àti ìyókù SAM (tí kìí ṣe IPR, Àwòrán 5f) jọra, èyí tó fihàn pé ìyàtọ̀ nínú àmì GA láàrín àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR àti àwọn tí kìí ṣe IPR kò ní ipa pàtàkì lórí ìpín sẹ́ẹ̀lì. Èyí, àti ìbáṣepọ̀ rere láàrín àmì GA àti anisotropy ìdàgbàsókè, mú kí a ronú bóyá ìṣiṣẹ́ àmì GA lè ní ipa lórí ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì. A wọn ìtọ́sọ́nà ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun gẹ́gẹ́ bí igun tó lágbára ní ìbámu pẹ̀lú axis radial tó so àárín meristem àti àárín ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun pọ̀ (Àwòrán 5e-i) a sì kíyèsí ìtẹ̀sí tó ṣe kedere fún àwọn sẹ́ẹ̀lì láti pín ní àwọn igun tó sún mọ́ 90° ní ìbámu pẹ̀lú axis radial, pẹ̀lú àwọn ìtẹ̀sí tó ga jùlọ tí a rí ní 70–80° (23.28%) àti 80–90° (22.62%) (Àwòrán 5e,i), tó bá àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì mu ní ìtọ́sọ́nà yíká/ìyípadà (Àwòrán 5h). Láti ṣe àyẹ̀wò ipa tí ìfitónilétí GA ní sí ìwà ìpín sẹ́ẹ̀lì yìí, a ṣe àyẹ̀wò àwọn paramita ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR àti èyí tí kìí ṣe IPR lọ́tọ̀ọ̀tọ̀ (Àwòrán 5i). A ṣe akiyesi pe pinpin igun pipin ninu awọn sẹẹli IPR yatọ si ti awọn sẹẹli ti kii ṣe IPR tabi ninu awọn sẹẹli ni gbogbo SAM, pẹlu awọn sẹẹli IPR ti o ṣe afihan ipin ti o ga julọ ti awọn pipin sẹẹli ita/yika, iyẹn ni, 70–80° ati 80–90° (33.86% ati 30.71%, lẹsẹsẹ, awọn ipin ti o baamu) (Fig. 5i). Nitorinaa, awọn akiyesi wa ṣafihan ibatan laarin ifihan agbara GA giga ati itọsọna iyipo sẹẹli ti o sunmọ itọsọna iyipo, ti o jọra si ibatan laarin iṣẹ ifihan agbara GA ati anisotropy idagbasoke (Fig. 5c, d). Lati tun fi idi itọju aaye ti isopọ yii mulẹ, a wọn itọsọna iyipo pipin ninu awọn sẹẹli IPR ti o yi primordium ka bẹrẹ lati P3, niwọn igba ti a rii iṣẹ ifihan agbara GA ti o ga julọ ni agbegbe yii bẹrẹ lati P4 (Fig. 4). Awọn igun pipin ti IPR ni ayika P3 ati P4 ko fihan awọn iyatọ pataki ni iṣiro, botilẹjẹpe a ṣe akiyesi igbohunsafẹfẹ ti awọn pipin sẹẹli ita ni IPR ni ayika P4 (Fig. 5j). Sibẹsibẹ, ninu awọn sẹẹli IPR ti o wa ni ayika P5, iyatọ ninu itọsọna ti plane pipin sẹẹli di pataki ni iṣiro, pẹlu ilosoke didasilẹ ni igbohunsafẹfẹ ti awọn pipin sẹẹli transverse (Fig. 5j). Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe ifihan agbara GA le ṣakoso itọsọna ti awọn pipin sẹẹli ni SAM, eyiti o baamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju40,41 pe ifihan agbara GA giga le fa itọsọna ita ti awọn pipin sẹẹli ni IPR.
A ti sọtẹ́lẹ̀ pé àwọn sẹ́ẹ̀lì nínú IPR kò ní darapọ̀ mọ́ primordia ṣùgbọ́n wọ́n á fi sínú internodes2,42,43. Ìtọ́sọ́nà ìyípadà ti àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR lè yọrí sí ìṣètò àwòṣe ti àwọn ìlà gígùn onípele ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epidermal nínú àwọn internodes. Àwọn àkíyèsí wa tí a ṣàlàyé lókè fihàn pé àmì GA ṣeé ṣe kó ipa nínú ìlànà yìí nípa ṣíṣàkóso ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì.
Pípàdánù iṣẹ́ àwọn jínì DELLA púpọ̀ máa ń yọrí sí ìdáhùn GA onípele kan, a sì lè lo àwọn àyípadà della láti dán àbá yìí wò44. A kọ́kọ́ ṣàyẹ̀wò àwọn àpẹẹrẹ ìfarahàn àwọn jínì DELLA márùn-ún nínú SAM. Ìdàpọ̀ ìkọ̀wé ti ìlà GUS45 fihàn pé GAI, RGA, RGL1, àti RGL2 (sí ìwọ̀n díẹ̀) ni a fihàn nínú SAM (Àfikún À ... Nípa lílo ìlà pRGA::GFP-RGA, a tún rí i pé amuaradagba RGA ń kóra jọ sínú SAM, ṣùgbọ́n iye rẹ̀ ń dínkù ní ààlà bẹ̀rẹ̀ láti P4 (Àfikún Àwòrán 11j). Àkíyèsí ni pé, àwọn àpẹẹrẹ ìfihàn ti RGL3 àti RGA bá iṣẹ́ ìfihàn GA tí ó ga jùlọ mu nínú IPR, gẹ́gẹ́ bí qmRGA ṣe rí i (Àwòrán 4). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn dátà wọ̀nyí fihàn pé gbogbo DELLA ni a fihàn nínú SAM àti pé ìfihàn wọn papọ̀ tàn ká gbogbo SAM.
Lẹ́yìn náà, a ṣe àgbéyẹ̀wò àwọn pàrámítà ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú SAM irú wild-type (Ler, control) àti gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Àwòrán 6a, b). Lọ́nà tó yani lẹ́nu, a kíyèsí ìyípadà pàtàkì nínú ìpínkiri àwọn frequency division angle frequency nínú della global mutant SAM ní ìfiwéra pẹ̀lú wild type (Àwòrán 6c). Ìyípadà yìí nínú della global mutant jẹ́ nítorí ìbísí nínú frequency ti 80–90° igun (34.71% vs. 24.55%) àti, dé ìwọ̀n díẹ̀, 70–80° igun (23.78% vs. 20.18%), ìyẹn ni pé, ó bá àwọn frequency cell partner mutants mu (Àwòrán 6c). Ìgbésí ayé àwọn frequency non-transverse divisions (0–60°) tún kéré sí nínú della global mutant (Àwòrán 6c). Ìwọ̀n ìgbà tí àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì transverse pọ̀ sí i ní SAM ti della global mutant (Àwòrán 6b). Ìwọ̀n ìgbà tí àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì transverse ní IPR náà ga sí i ní della global mutant ní ìfiwéra pẹ̀lú irú wild (Àwòrán 6d). Ní ìta agbègbè IPR, irú wild ní ìpínkiri tó dọ́gba ti àwọn igun ìpín sẹ́ẹ̀lì, nígbà tí della global mutant fẹ́ràn àwọn ìpínkiri tangential bíi IPR (Àwòrán 6e). A tún ṣe ìṣírò ìtọ́sọ́nà àwọn ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú SAM ti àwọn mutant quintuple ga2 oxidase (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, àti ga2ox6-2), ìpìlẹ̀ mutant GA tí GA ń kó jọ. Gẹ́gẹ́ bí ìbísí nínú ipele GA, SAM ti ìpìlẹ̀ṣẹ̀ ga2ox mutant quintuple tóbi ju ti Col-0 lọ (Àfikún Àwòrán 12a, b), àti ní ìfiwéra pẹ̀lú Col-0, quintuple ga2ox SAM fi ìpínkiri tó yàtọ̀ hàn kedere ti àwọn igun ìpínkiri sẹ́ẹ̀lì, pẹ̀lú ìgbóná igun náà ń pọ̀ sí i láti 50° sí 90°, ìyẹn ni pé ó tún ń fẹ́ àwọn ìpínkiri tangential (Àfikún Àwòrán 12a–c). Nítorí náà, a fihàn pé ìṣiṣẹ́ onípele ti ìfàmì sí GA àti ìkójọpọ̀ GA ń fa ìpínkiri sẹ́ẹ̀lì ní IPR àti ìyókù SAM.
a, b ìwòran 3D ti fẹlẹfẹlẹ L1 ti Ler ti a ya PI (a) ati mutant della agbaye (b) SAM nipa lilo maikirosikopu confocal. Awọn odi sẹẹli tuntun ti a ṣe ninu SAM (ṣugbọn kii ṣe primordium) lori akoko wakati 10 ni a fihan ati awọ ni ibamu si awọn iye igun wọn. Inset naa fihan SAM ni 0 h. A fihan ọpa awọ ni igun apa ọtun isalẹ. Ọfà ninu (b) tọka si apẹẹrẹ ti awọn faili sẹẹli ti a ṣe deede ninu mutant della agbaye. A tun ṣe idanwo naa lẹẹmeji pẹlu awọn abajade kanna. afiwe ce ti pinpin igbohunsafẹfẹ ti awọn itọsọna pipọ sẹẹli ni gbogbo SAM (d), IPR (e), ati ti kii ṣe IPR (f) laarin Ler ati della agbaye. Awọn iye P ni a gba nipa lilo idanwo Kolmogorov-Smirnov onirin meji. f, g Ifihan 3D ti awọn aworan confocal ti SAM ti a ya PI ti Col-0 (i) ati pCUC2::gai-1-VENUS (j) awọn eweko transgenic. Àwọn pánẹ́lì (a, b) fi àwọn ògiri sẹ́ẹ̀lì tuntun hàn (ṣùgbọ́n kìí ṣe primordia) tí a ṣe nínú SAM láàrín wákàtí 10. A tún ṣe ìdánwò náà lẹ́ẹ̀mejì pẹ̀lú àwọn àbájáde tó jọra. h–j Ìfiwéra ìpínkiri ìgbòkègbodò ti àwọn ìtọ́sọ́nà ìpínkiri sẹ́ẹ̀lì tí ó wà nínú gbogbo SAM (h), IPR (i) àti èyí tí kìí ṣe IPR (j) láàrín àwọn ohun ọ̀gbìn Col-0 àti pCUC2::gai-1-VENUS. A gba àwọn ìwọ̀n P nípa lílo ìdánwò Kolmogorov–Smirnov onírù méjì.
A tún dán ipa tí ó ní nínú dídínà àmì GA ní pàtó nínú IPR. Fún èyí, a lo olùgbékalẹ̀ cotyledon cup 2 (CUC2) láti mú kí ìfarahàn prótínì gai-1 tí ó jẹ́ odi tí a so pọ̀ mọ́ VENUS (nínú ìlà pCUC2::gai-1-VENUS). Nínú SAM irú wild-type, olùgbékalẹ̀ CUC2 ń mú ìfarahàn ọ̀pọ̀lọpọ̀ IPRs nínú SAM, títí kan àwọn sẹ́ẹ̀lì border, láti P4 síwájú, a sì rí ìfarahàn pàtó kan náà nínú àwọn ewéko pCUC2::gai-1-VENUS (wo ìsàlẹ̀). Pínpín àwọn igun ìpín sẹ́ẹ̀lì kọjá SAM tàbí IPR ti àwọn ewéko pCUC2::gai-1-VENUS kò yàtọ̀ sí ti irú wild, bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ṣàwárí pé àwọn sẹ́ẹ̀lì tí kò ní IPR nínú àwọn ewéko wọ̀nyí pín sí ìgbóná gíga ti 80–90° (Àwòrán 6f–j).
A ti daba pe itọsọna pipin sẹẹli da lori iwọn SAM, paapaa wahala tensile ti a ṣẹda nipasẹ curvature tissue46. Nitorinaa a beere boya apẹrẹ SAM ti yipada ninu awọn irugbin mutant della global ati pCUC2::gai-1-VENUS. Gẹgẹbi a ti royin tẹlẹ12, iwọn ti mutant della global SAM tobi ju ti iru ẹranko lọ (Afikun Fig. 13a, b, d). In situ hybridization ti CLV3 ati STM RNA jẹrisi imugboroosi meristem ni awọn mutant della ati siwaju fihan imugboroosi ita ti niche sẹẹli stem (Afikun Fig. 13e, f, h, i). Sibẹsibẹ, curvature SAM jọra ni awọn genotypes mejeeji (Afikun Fig. 13k, m, n, p). A rí ìbísí tó jọra nínú ìwọ̀n nínú gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant láìsí ìyípadà nínú ìyípo ní ìfiwéra pẹ̀lú irú wild (Àfikún Àwòrán 13c, d, g, j, l, o, p). Ìwọ̀n ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì náà tún ní ipa lórí mutant della quadruple, ṣùgbọ́n sí ìwọ̀n tó kéré sí ti mutant della monolithic (Àfikún Àwòrán 12d–f). Ìpa ìwọ̀n yìí, pẹ̀lú àìní ipa lórí ìyípo, fihàn pé ìṣiṣẹ́ RGL3 tó kù nínú mutant quadruple Della dín àwọn ìyípadà nínú ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì kù tí ó fa ìpàdánù iṣẹ́ DELLA àti pé àwọn ìyípadà nínú ìpín sẹ́ẹ̀lì lateral wáyé ní ìdáhùn sí àwọn ìyípadà nínú iṣẹ́ ìfàmì GA dípò àwọn ìyípadà nínú geometry SAM. Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè, olùgbékalẹ̀ CUC2 ń darí ìgbékalẹ̀ IPR nínú SAM tí ó bẹ̀rẹ̀ láti P4 (Àfikún Àwòrán 14a, b), àti ní ìyàtọ̀, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ní ìwọ̀n tí ó dínkù ṣùgbọ́n ìyípo tí ó ga jù (Àfikún Àwòrán 14c–h). Ìyípadà yìí nínú ìrísí pCUC2::gai-1-VENUS SAM lè yọrí sí ìpínkiri àwọn ìkìmọ́lẹ̀ ẹ̀rọ tí ó yàtọ̀ sí irú egan, nínú èyí tí àwọn ìkìmọ́lẹ̀ àyíká gíga ti bẹ̀rẹ̀ ní ìjìnnà kúkúrú sí SAM center47. Ní ọ̀nà mìíràn, àwọn ìyípadà nínú ìrísí pCUC2::gai-1-VENUS SAM lè jẹ́yọ láti inú àwọn ìyípadà nínú àwọn ohun-ìní ẹ̀rọ agbègbè tí ìgbékalẹ̀ transgene48 fà. Nínú àwọn ọ̀ràn méjèèjì, èyí lè dín àwọn ipa àwọn ìyípadà nínú ìfiranṣẹ́ GA kù díẹ̀ nípa mímú kí ó ṣeéṣe kí àwọn sẹ́ẹ̀lì pínyà nínú ìtọ́sọ́nà àyíká/ìyípadà, tí ó ń ṣàlàyé àwọn àkíyèsí wa.
Ní àpapọ̀, àwọn ìwádìí wa fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé àmì GA gíga ń kó ipa pàtàkì nínú ìtọ́sọ́nà ẹ̀gbẹ́ ti ètò ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR. Wọ́n tún fihàn pé ìtẹ̀sí meristem tún ní ipa lórí ìtọ́sọ́nà ètò ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR.
Ìtọ́sọ́nà ìyípadà ti ìpínyà nínú IPR, nítorí iṣẹ́ ìfàmì GA gíga, fihàn pé GA ń ṣètò fáìlì sẹ́ẹ̀lì radial kan nínu epidermis nínú SAM láti ṣàlàyé ìṣètò sẹ́ẹ̀lì tí a ó rí nínu epidermal internode nígbà tó bá yá. Ní tòótọ́, irú àwọn fáìlì sẹ́ẹ̀lì bẹ́ẹ̀ sábà máa ń hàn nínú àwọn àwòrán SAM ti àwọn mutants global della (Àwòrán 6b). Nítorí náà, láti túbọ̀ ṣe àwárí iṣẹ́ ìdàgbàsókè ti àpẹẹrẹ ìfàmì GA nínú SAM, a lo àwòrán àkókò-láìpẹ́ láti ṣe àyẹ̀wò ìṣètò àwọn sẹ́ẹ̀lì nínú IPR nínú irú wild-type (Ler àti Col-0), àwọn mutants della global, àti àwọn igi transgenic pCUC2::gai-1-VENUS.
A rí i pé qmRGA fihàn pé iṣẹ́ ìfàmì GA nínú IPR pọ̀ sí i láti P1/P2 ó sì dé òkè ní P4, ìlànà yìí sì dúró ṣinṣin ní àkókò kan náà (Àwòrán 4a–f àti Àfikún Àwòrán 8c–f, k). Láti ṣe àgbéyẹ̀wò ìṣètò ààyè àwọn sẹ́ẹ̀lì nínú IPR pẹ̀lú àmì GA tí ń pọ̀ sí i, a fi àmì Ler IPR sí àwọn sẹ́ẹ̀lì lókè àti sí ẹ̀gbẹ́ P4 gẹ́gẹ́ bí àyànmọ́ ìdàgbàsókè wọn ṣe àgbéyẹ̀wò ní wákàtí 34 lẹ́yìn àkíyèsí àkọ́kọ́, ìyẹn ni pé, ju ìgbà méjì lọ tí a fi plastid ṣe, èyí tí ó jẹ́ kí a tẹ̀lé àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR nígbà ìdàgbàsókè primordium láti P1/P2 sí P4. A lo àwọn àwọ̀ mẹ́ta tó yàtọ̀ síra: ofeefee fún àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a fi sínú primordium nítòsí P4, ewé fún àwọn tí ó wà nínú IPR, àti elése àlùkò fún àwọn tí ó kópa nínú àwọn ìlànà méjèèjì (Àwòrán 7a–c). Ní t0 (0 h), a rí àwọn ìpele 1–2 ti àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR ní iwájú P4 (Àwòrán 7a). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe retí, nígbà tí àwọn sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí pín sí méjì, wọ́n ṣe bẹ́ẹ̀ ní pàtàkì nípasẹ̀ ìpínkiri transverse (Àwòrán 7a–c). Àwọn àbájáde tó jọra ni a rí nípa lílo Col-0 SAM (tí ó dojúkọ P3, tí ààlà rẹ̀ jọ P4 ní Ler), bó tilẹ̀ jẹ́ pé nínú ìrísí yìí, ìdìpọ̀ tí a ṣe ní ààlà ododo fi àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR pamọ́ kíákíá (Àwòrán 7g–i). Nítorí náà, ìlànà ìpínyà àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR mú kí àwọn sẹ́ẹ̀lì náà wà ní ìlà radial, gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú internodes. Ìṣètò àwọn ìlà radial àti ìṣàfihàn àwọn sẹ́ẹ̀lì IPR láàrín àwọn ẹ̀yà ara tí ó tẹ̀lé ara fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì wọ̀nyí jẹ́ àwọn ọmọ-ẹ̀yìn internodal.
Níbí, a ṣe àgbékalẹ̀ biosensor GA signaling bio, qmRGA, tí ó gba àfikún ìṣàfihàn iye iṣẹ́ ìfàmì GA tí ó wá láti inú àpapọ̀ ìfọ́pọ̀ GA àti GA receptor nígbàtí ó ń dín ìdènà kù pẹ̀lú àwọn ipa ọ̀nà ìfàmì GA ní ìpele sẹ́ẹ̀lì. Fún èyí, a kọ́ amuaradagba DELLA tí a yípadà, mRGA, tí ó ti pàdánù agbára láti so àwọn alábáṣiṣẹpọ̀ ìbáṣepọ̀ DELLA ṣùgbọ́n ó ṣì ní ìmọ̀lára sí proteolysis tí GA fa. qmRGA dáhùn sí àwọn ìyípadà exogenous àti endogenous nínú àwọn ìpele GA, àti àwọn ànímọ́ ìfàmì dynamic rẹ̀ ń jẹ́ kí a ṣe àyẹ̀wò àwọn ìyípadà spatiotemporal nínú iṣẹ́ ìfàmì GA nígbà ìdàgbàsókè. qmRGA tún jẹ́ ohun èlò tí ó rọrùn gan-an nítorí pé a lè ṣe àtúnṣe sí àwọn àsopọ onírúurú nípa yíyípadà olùgbékalẹ̀ tí a lò fún ìfihàn rẹ̀ (tí ó bá pọndandan), àti nítorí ìwà tí a fipamọ́ ti ipa ọ̀nà ìfàmì GA àti PFYRE motif kọjá àwọn angiosperms, ó ṣeéṣe kí ó ṣeé gbé lọ sí àwọn ẹ̀yà mìíràn22. Ní ìbámu pẹ̀lú èyí, ìyípadà tó dọ́gba nínú ìrẹsì SLR1 DELLA protein (HYY497AAA) ni a tún fihàn pé ó dín ìṣiṣẹ́ ìdènà ìdàgbàsókè ti SLR1 kù nígbàtí ó dín ìbàjẹ́ GA rẹ̀ kù díẹ̀, tí ó jọ mRGA23. Lóòótọ́, àwọn ìwádìí tuntun nínú Arabidopsis fihàn pé ìyípadà amino acid kan ṣoṣo nínú agbègbè PFYRE (S474L) yí ìṣiṣẹ́ ìkọ̀wé ti RGA padà láìní ipa lórí agbára rẹ̀ láti bá àwọn alábàáṣiṣẹpọ̀ transcription factor partners50 lò. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìyípadà yìí sún mọ́ àwọn ìyípadà amino acid mẹ́ta tí ó wà nínú mRGA, àwọn ìwádìí wa fihàn pé àwọn ìyípadà méjì wọ̀nyí yí àwọn ànímọ́ pàtó ti DELLA padà. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn alábàáṣiṣẹpọ̀ transcription factor so mọ́ àwọn agbègbè LHR1 àti SAW ti DELLA26,51, àwọn amino acids kan tí a pamọ́ nínú agbègbè PFYRE lè ṣe ìrànlọ́wọ́ láti mú àwọn ìbáṣepọ̀ wọ̀nyí dúró ṣinṣin.
Ìdàgbàsókè internode jẹ́ àmì pàtàkì nínú ìṣètò igi àti ìdàgbàsókè èso. qmRGA fi iṣẹ́ àmì GA tí ó ga hàn nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì progenitor internode IPR. Nípa sísopọ̀ àwòrán oníwọ̀n àti ìbílẹ̀ pọ̀, a fihàn pé àwọn àpẹẹrẹ àmì GA ń borí àwọn pípín sẹ́ẹ̀lì onígun/àyíká nínú SAM epidermis, tí ó ń ṣe àkóso ìpín sẹ́ẹ̀lì tí a nílò fún ìdàgbàsókè internode. Ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn olùṣàkóso ti ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì ni a ti ṣàwárí nígbà ìdàgbàsókè52,53. Iṣẹ́ wa pèsè àpẹẹrẹ tí ó ṣe kedere ti bí iṣẹ́ àmì GA ṣe ń ṣe àkóso paramita sẹ́ẹ̀lì yìí. DELLA le bá àwọn èròjà amuaradagba tí ń ṣáájú ìforígbárí mu41, nítorí náà àmì GA le ṣe àkóso ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì nípa lílo ìtọ́sọ́nà microtubule cortical taara40,41,54,55. A fihàn láìròtẹ́lẹ̀ pé nínú SAM, ìbáṣepọ̀ iṣẹ́ àmì GA tí ó ga jùlọ kì í ṣe ìfàgùn sẹ́ẹ̀lì tàbí ìpín, ṣùgbọ́n anisotropy ìdàgbàsókè nìkan, èyí tí ó bá ipa taara ti GA lórí ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR mu. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò le ṣe àìfẹ́yọrí pé ipa yìí tún le jẹ́ àìtaara, fún àpẹẹrẹ nípasẹ̀ ìrọ̀rùn sẹ́ẹ̀lì sẹ́ẹ̀lì tí GA fa nípasẹ̀ ògiri sẹ́ẹ̀lì56. Àwọn ìyípadà nínú àwọn ohun-ìní ògiri sẹ́ẹ̀lì máa ń fa ìdààmú ẹ̀rọ57,58, èyí tí ó tún lè nípa lórí ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì nípa níní ipa lórí ìtọ́sọ́nà àwọn microtubules cortical39,46,59. Àwọn ipa àpapọ̀ ti ìdààmú ẹ̀rọ tí GA fà àti ìṣètò taara ti ìtọ́sọ́nà microtubule nípasẹ̀ GA lè ní ipa nínú ṣíṣẹ̀dá àpẹẹrẹ pàtó kan ti ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú IPR láti ṣàlàyé àwọn internodes, a sì nílò àwọn ìwádìí síwájú síi láti dán èrò yìí wò. Bákan náà, àwọn ìwádìí ìṣáájú ti tẹnu mọ́ pàtàkì àwọn prótéènì tí ń ṣe ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú DELLA TCP14 àti 15 nínú ìṣàkóso ìṣẹ̀dá internode60,61 àti àwọn ohun wọ̀nyí lè ṣe ìbáṣepọ̀ iṣẹ́ GA pẹ̀lú BREVIPEDICELLUS (BP) àti PENNYWISE (PNY), tí ó ń ṣe ìṣàkóso ìdàgbàsókè internode tí a sì ti fihàn pé ó ní ipa lórí ìtọ́sọ́nà GA2,62. Nítorí pé DELLAs ń bá àwọn ọ̀nà ìtọ́sọ́nà brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, àti abscisic acid (ABA) sọ̀rọ̀63,64 àti pé àwọn homonu wọ̀nyí lè ní ipa lórí ìtọ́sọ́nà microtubule65, àwọn ipa ti GA lórí ìtọ́sọ́nà ìpín sẹ́ẹ̀lì lè jẹ́ ti àwọn homonu mìíràn.
Àwọn ìwádìí ìpilẹ̀ṣẹ̀ nípa sẹ́ẹ̀lì fihàn pé àwọn agbègbè inú àti òde ti Arabidopsis SAM ni a nílò fún ìdàgbàsókè internode2,42. Òtítọ́ náà pé GA ń ṣàkóso ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú àwọn àsopọ inú12 ń ṣe àtìlẹ́yìn fún iṣẹ́ méjì ti GA ní ṣíṣàkóso ìwọ̀n meristem àti internode nínú SAM. Àpẹẹrẹ ìpín sẹ́ẹ̀lì ìtọ́sọ́nà tún ní ìlànà tí ó péye nínú àsopọ SAM inú, ìlànà yìí sì ṣe pàtàkì fún ìdàgbàsókè stem52. Yóò jẹ́ ohun tí ó dùn mọ́ni láti ṣàyẹ̀wò bóyá GA tún ń kó ipa nínú títọ́ ètò ìpín sẹ́ẹ̀lì nínú àjọ SAM inú, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń mú kí ìpele àti ìdàgbàsókè internodes láàrín SAM báradọ́gba.
A gbin awọn irugbin ni vitro ninu ile tabi 1x Murashige-Skoog (MS) alabọde (Duchefa) ti a fi 1% sucrose kun ati 1% agar (Sigma) labẹ awọn ipo boṣewa (ina wakati 16, 22 °C), ayafi awọn idanwo hypocotyl ati idagbasoke gbongbo ninu eyiti a gbin awọn irugbin lori awọn awo inaro labẹ ina nigbagbogbo ati 22 °C. Fun awọn idanwo nitrate, a gbin awọn irugbin lori alabọde MS ti a yipada (bioWORLD ọgbin alabọde) ti a fi nitrate to peye kun (0 tabi 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ati 1% A-agar (Sigma) labẹ awọn ipo ọjọ pipẹ.
A tún so GID1a cDNA tí a fi sínú pDONR221 pọ̀ mọ́ pDONR P4-P1R-pUBQ10 àti pDONR P2R-P3-mCherry sínú pB7m34GW láti ṣe pUBQ10::GID1a-mCherry. A tún so DNA IDD2 tí a fi sínú pDONR221 pọ̀ mọ́ pB7RWG266 láti ṣe p35S:IDD2-RFP. Láti ṣe ìṣẹ̀dá pGID1b::2xmTQ2-GID1b, a kọ́kọ́ mú ìpín 3.9 kb kan tí ó wà ní òkè agbègbè ìkọ̀wé GID1b àti ìpín 4.7 kb tí ó ní GID1b cDNA (1.3 kb) àti ìpín terminator (3.4 kb) pọ̀ sí i nípa lílo àwọn primers nínú Àfikún Táblì 3, lẹ́yìn náà a fi sínú pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) àti pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), lẹ́sẹẹsẹ, ní ìkẹyìn a tún so pọ̀ mọ́ pDONR221 2xmTQ268 sínú vector àfojúsùn pGreen 012567 nípa lílo cloning Gateway. Láti ṣe ìṣẹ̀dá pCUC2::LSSmOrange, a ṣe àkójọpọ̀ ìtẹ̀lé CUC2 promoter sequence (3229 bp ní òkè ATG) pẹ̀lú ìtẹ̀lé ìkọ̀wé ti mOrange ńlá Stokes-shifted (LSSmOrange)69 pẹ̀lú àmì ìṣètò ibi-agbára N7 àti ìdènà ìkọ̀wé NOS sínú ìtẹ̀lé ìtajà pGreen kanamycin nípa lílo ètò ìdàpọ̀ ìpín-ẹ̀yà Gateway 3 (Invitrogen). A ṣe àkójọpọ̀ ìtẹ̀lé binary ewéko náà sínú ìpele Agrobacterium tumefaciens GV3101, a sì fi sínú ewé Nicotiana benthamiana nípa lílo ọ̀nà ìfàmọ́ra Agrobacterium àti sínú Arabidopsis thaliana Col-0 nípa lílo ọ̀nà díp floral, lẹ́sẹẹsẹ. a ya pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry àti pCLV3::mCherry-NLS qmRGA sọ́tọ̀ láti inú àwọn ọmọ F3 àti F1 ti àwọn àgbélébùú kọ̀ọ̀kan, lẹ́sẹẹsẹ.
A ṣe àgbékalẹ̀ ìdàpọ̀ RNA in situ lórí àwọn ìlà ìfàgùn tó tó nǹkan bíi 1 cm72, èyí tí a kó jọ, a sì fi sínú omi FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) tí a ti mú kí ó tutù sí 4 °C. Lẹ́yìn ìtọ́jú ìfọ́mọ́ fún ìṣẹ́jú 2 × 15, a yí àtúnṣe náà padà, a sì fi àwọn àpẹẹrẹ sínú rẹ̀ ní alẹ́. A fi àwọn ìṣàfihàn GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, àti RGL3 cDNAs àti àwọn ìwádìí antisense sí 3′-UTR wọn ṣe àgbékalẹ̀ wọn nípa lílo àwọn primers tí a fihàn nínú Àtẹ Àfikún 3 gẹ́gẹ́ bí Rosier et al.73 ṣe ṣàlàyé rẹ̀. A lo àwọn ohun tí a fi àmì Digoxigenin ṣe láti fi àwọn èròjà ara tí a fi àmì Digoxigenin ṣe àyẹ̀wò nípa lílo àwọn èròjà ara tí a fi àmì Digoxigenin ṣe (ìfọ́pọ̀ ìlọ́po 3000; Roche, nọ́mbà àkójọpọ̀: 11 093 274 910), a sì fi omi 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, ìfọ́pọ̀ ìlọ́po 250)/nitroblue tetrazolium (NBT, ìfọ́pọ̀ ìlọ́po 200) kun àwọn apá náà.
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Feb-10-2025