Iyaworan apical meristem (SAM) idagba jẹ pataki fun isọdọmọ faaji. Awọn homonu ọgbingibberellins(GAs) ṣe awọn ipa pataki ni ṣiṣakoso idagbasoke ọgbin, ṣugbọn ipa wọn ninu SAM ko ni oye ti ko dara. Nibi, a ṣe agbekalẹ biosensor biometric kan ti ifihan ifihan GA nipasẹ ṣiṣe ẹrọ amuaradagba DELLA lati dinku iṣẹ ilana pataki rẹ ni esi transcriptional GA lakoko titọju ibajẹ rẹ lori idanimọ GA. A ṣe afihan pe biosensor ti o da lori ibajẹ yii ṣe igbasilẹ deede awọn iyipada ni awọn ipele GA ati oye cellular lakoko idagbasoke. A lo biosensor yii lati ya aworan iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ni SAM. A fihan pe awọn ifihan agbara GA giga wa ni pataki julọ ninu awọn sẹẹli ti o wa laarin primordia eto ara, eyiti o jẹ awọn iṣaaju si awọn sẹẹli internode. Lilo awọn isunmọ ere- ati isonu-ti-iṣẹ, a ṣe afihan siwaju pe GA n ṣe ilana iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli, iṣeto ti eto cellular canonical ti internodes, nitorinaa igbega sipesifikesonu internode ni SAM.
Awọn titu apical meristem (SAM), ti o wa ni apex titu, ni onakan ti awọn sẹẹli yio ti iṣẹ ṣiṣe n ṣe agbekalẹ awọn ara ti ita ati awọn apa ita ni ọna modular ati arosọ jakejado igbesi aye ọgbin naa. Ọkọọkan ninu awọn ẹya atunwi wọnyi, tabi awọn apa ọgbin, pẹlu awọn internodes ati awọn ara ita ni awọn apa, ati awọn meristems axillary ninu awọn axils ewe1. Idagba ati iṣeto ti awọn apa ọgbin yipada lakoko idagbasoke. Ni Arabidopsis, idagbasoke internodal ti wa ni idinku lakoko ipele ewe, ati awọn meristems axillary duro ni awọn axils ti awọn ewe rosette. Lakoko iyipada si ipele ti ododo, SAM naa di meristem inflorescence, ti o ṣẹda awọn internodes elongated ati awọn eso axillary, awọn ẹka ni awọn axils ti awọn ewe cauline, ati nigbamii, awọn ododo ti ko ni ewe2. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ti tẹ̀ síwájú gan-an ní òye àwọn ọ̀nà tó ń darí bíbẹ̀rẹ̀ àwọn ewé, òdòdó, àti ẹ̀ka ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ìwọ̀nba díẹ̀ ni a mọ̀ nípa bí internodes ṣe dìde.
Imọye pinpin spatiotemporal ti GA yoo ṣe iranlọwọ lati ni oye daradara awọn iṣẹ ti awọn homonu wọnyi ni awọn oriṣiriṣi awọn ara ati ni awọn ipele idagbasoke ti o yatọ. Wiwo ti ibajẹ ti idapọ RGA-GFP ti a fihan labẹ iṣe ti olupolowo tirẹ pese alaye pataki lori ilana ti awọn ipele GA lapapọ ni awọn gbongbo15,16. Sibẹsibẹ, ikosile RGA yatọ kọja awọn tissues17 ati pe GA18 ti ṣe ilana rẹ. Nitorinaa, ikosile iyatọ ti olupolowo RGA le ja si ni ilana fluorescence ti a ṣe akiyesi pẹlu RGA-GFP ati nitorinaa ọna yii kii ṣe iwọn. Laipẹ diẹ, bioactive fluorescein (Fl) -aami GA19,20 ṣe afihan ikojọpọ GA ni endocortex root ati ilana awọn ipele cellular rẹ nipasẹ gbigbe GA. Laipẹ, sensọ GA FRET nlsGPS1 fihan pe awọn ipele GA ni ibamu pẹlu elongation sẹẹli ni awọn gbongbo, filaments, ati hypocotyls21 ti o ṣokunkun. Bibẹẹkọ, bi a ti rii, ifọkansi GA kii ṣe paramita nikan ti n ṣakoso iṣẹ ami ifihan GA, bi o ṣe da lori awọn ilana oye idiju. Nibi, ti n kọ lori oye wa ti awọn ipa ọna ifihan DELLA ati GA, a ṣe ijabọ idagbasoke ati isọdi ti ajẹsara-orisun biometric biosensor fun ifihan ifihan GA. Lati ṣe agbekalẹ biosensor pipo yii, a lo iyipada GA-sensitive RGA ti a dapọ si amuaradagba Fuluorisenti ati ni gbogbo ibi ti a fihan ni awọn tisọ, bakanna bi amuaradagba fluorescent ti ko ṣe pataki GA. A fihan pe awọn idapọmọra amuaradagba RGA mutant ko ni dabaru pẹlu ifihan ifihan GA endogenous nigbati a fihan ni gbogbo ibi, ati pe biosensor yii le ṣe iwọn iṣẹ ṣiṣe ifihan ti o waye lati inu titẹ GA mejeeji ati sisẹ ifihan agbara GA nipasẹ ohun elo oye pẹlu ipinnu aaye giga giga. A lo biosensor yii lati ṣe maapu pinpin spatiotemporal ti iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ati ṣe iwọn bi GA ṣe n ṣe ilana ihuwasi cellular ni epidermis SAM. A ṣe afihan pe GA n ṣe ilana iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin ti awọn sẹẹli SAM ti o wa laarin primordia eto ara, nitorinaa n ṣalaye agbari cellular canonical ti internode.
Lakotan, a beere boya qmRGA le jabo awọn ayipada ninu awọn ipele GA endogenous nipa lilo awọn hypocotyls dagba. A fihan tẹlẹ pe iyọ n ṣe idagbasoke idagbasoke nipasẹ jijẹ iṣelọpọ GA ati, lapapọ, ibajẹ DELLA34. Nitorinaa, a ṣe akiyesi pe gigun hypocotyl ni pUBQ10 ::qmRGA awọn irugbin ti o dagba labẹ ipese loore lọpọlọpọ (10 mM NO3-) jẹ pataki gun ju iyẹn lọ ninu awọn irugbin ti o dagba labẹ awọn ipo aipe loore (Afikun Fig. 6a). Ni ibamu pẹlu idahun idagba, awọn ifihan agbara GA ga ni awọn hypocotyls ti awọn irugbin ti o dagba labẹ awọn ipo 10 mM NO3- ju ninu awọn irugbin ti o dagba ni aini iyọ (Afikun 6b, c). Nitorinaa, qmRGA tun ngbanilaaye ibojuwo awọn ayipada ninu ifihan ifihan GA ti o fa nipasẹ awọn ayipada ailopin ni ifọkansi GA.
Lati loye boya iṣẹ ami ifihan GA ti a rii nipasẹ qmRGA da lori ifọkansi GA ati iwoye GA, bi a ti ṣe yẹ ti o da lori apẹrẹ sensọ, a ṣe itupalẹ ikosile ti awọn olugba GID1 mẹta ni awọn ohun elo ti ewe ati ibisi. Ninu awọn irugbin, laini onirohin GID1-GUS fihan pe GID1a ati c ti ṣafihan pupọ ni awọn cotyledons (Fig. 3a-c). Ni afikun, gbogbo awọn olugba mẹta ni a fi han ni awọn leaves, primordia root ita, awọn imọran root (ayafi fun ipilẹ ti GID1b), ati eto iṣan (Fig. 3a-c). Ninu inflorescence SAM, a ṣe awari awọn ifihan agbara GUS nikan fun GID1b ati 1c (Afikun Afikun. 7a-c). Ni ipo arabara arabara jẹrisi awọn ilana ikosile wọnyi ati ṣafihan siwaju pe GID1c ti ṣafihan ni iṣọkan ni awọn ipele kekere ni SAM, lakoko ti GID1b ṣe afihan ikosile ti o ga julọ ni ẹba ti SAM (Afikun Afikun. 7d-l). Iṣọkan itumọ pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b tun ṣafihan iwọn iwọn ti GID1b ikosile, lati kekere tabi ko si ikosile ni aarin ti SAM si ikosile giga ni awọn aala eto ara (Afikun Fig. 7m). Nitorinaa, awọn olugba GID1 ko pin kaakiri ati laarin awọn tisọ. Ninu awọn adanwo ti o tẹle, a tun ṣe akiyesi pe overexpression ti GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) pọ si ifamọ ti qmRGA ni hypocotyls si ohun elo GA ita (Fig. 3d, e). Ni idakeji, fluorescence ti a ṣe nipasẹ qd17mRGA ni hypocotyl jẹ aibikita si itọju GA3 (Fig. 3f, g). Fun awọn ayẹwo mejeeji, a ṣe itọju awọn irugbin pẹlu awọn ifọkansi giga ti GA (100 μM GA3) lati ṣe ayẹwo ihuwasi iyara ti sensọ, nibiti agbara lati sopọ mọ olugba GID1 ti mu dara tabi sọnu. Lapapọ, awọn abajade wọnyi jẹrisi pe qmRGA biosensor ṣe iṣẹ iṣẹ apapọ bi sensọ GA ati GA, ati daba pe ikosile iyatọ ti olugba GID1 le ṣe pataki iyipada imukuro sensọ naa.
Titi di oni, pinpin awọn ifihan agbara GA ni SAM ko ṣiyemeji. Nitorinaa, a lo awọn ohun ọgbin ti n ṣalaye qmRGA ati pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 lati ṣe iṣiro awọn maapu pipo ti o ga julọ ti iṣẹ ifihan GA, ti o fojusi lori Layer L1 (epidermis; Fig. 4a, b, wo Awọn ọna ati Awọn ọna Afikun), niwon L1 ṣe ipa pataki ninu iṣakoso SAM. Nibi, pCLV3 :: mCherry-NLS ikosile pese aaye itọkasi jiometirika ti o wa titi fun ṣiṣe ayẹwo pinpin aye-aye ti iṣẹ ifihan GA37. Botilẹjẹpe GA ni a ka pe o ṣe pataki fun idagbasoke awọn ẹya ara ita4, a ṣe akiyesi pe awọn ifihan agbara GA kere ni primordium ododo (P) ti o bẹrẹ lati ipele P3 (Fig. 4a, b), lakoko ti awọn ọdọ P1 ati P2 primordiums ni iṣẹ-iwọntunwọnsi ti o jọra si iyẹn ni agbegbe aarin (Fig. 4a, b). Iṣẹ ifihan ifihan GA ti o ga julọ ni a rii ni awọn aala primordium eto ara, ti o bẹrẹ ni P1 / P2 (ni awọn ẹgbẹ ti aala) ati peaking ni P4, bakanna ni gbogbo awọn sẹẹli ti agbegbe agbeegbe ti o wa laarin primordia (Fig. 4a, b ati Apọju 8a, b). Iṣẹ ami ifihan GA ti o ga julọ ni a ṣe akiyesi kii ṣe ni epidermis nikan ṣugbọn tun ni awọn ipele L2 ati L3 oke (Afikun 8b). Apẹrẹ ti awọn ifihan agbara GA ti a rii ni SAM nipa lilo qmRGA tun wa ko yipada ni akoko pupọ (Afikun. 8c–f, k). Botilẹjẹpe iṣelọpọ qd17mRGA ti dinku ni ọna ṣiṣe ni SAM ti awọn irugbin T3 lati awọn laini ominira marun ti a ṣe afihan ni awọn alaye, a ni anfani lati ṣe itupalẹ awọn ilana fluorescence ti a gba pẹlu pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP itumọ (Fig. 8g-j, l). Ninu laini iṣakoso yii, awọn ayipada kekere nikan ni ipin fluorescence ni a rii ni SAM, ṣugbọn ni ile-iṣẹ SAM a ṣe akiyesi idinku ti o han gbangba ati airotẹlẹ ni VENUS ti o ni nkan ṣe pẹlu TagBFP. Eyi jẹri pe apẹẹrẹ ifihan ti a ṣe akiyesi nipasẹ qmRGA ṣe afihan ibajẹ-igbẹkẹle GA ti mRGA-VENUS, ṣugbọn tun ṣe afihan pe qmRGA le ṣe apọju iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ni ile-iṣẹ meristem. Ni akojọpọ, awọn abajade wa ṣe afihan ilana isamisi GA kan ti o ṣe afihan pinpin akọkọ ti primordia. Pipin agbegbe ti aarin-primordial (IPR) jẹ nitori idasile mimu ti iṣẹ ifihan GA giga laarin primordium to sese ndagbasoke ati agbegbe aarin, lakoko kanna iṣẹ ifihan GA ni primordium dinku (Fig. 4c, d).
Pipin awọn olugba GID1b ati GID1c (wo loke) ni imọran pe ikosile iyatọ ti awọn olugba GA ṣe iranlọwọ lati ṣe apẹrẹ ti iṣẹ ifihan GA ni SAM. A ṣe iyalẹnu boya ikojọpọ iyatọ ti GA le ni ipa. Lati ṣe iwadii iṣeeṣe yii, a lo nlsGPS1 GA FRET sensor21. Igbohunsafẹfẹ imuṣiṣẹ pọsi ni a rii ni SAM ti nlsGPS1 ti a tọju pẹlu 10 μM GA4 + 7 fun iṣẹju 100 (Afikun 9a-e), ti o nfihan pe nlsGPS1 ṣe idahun si awọn iyipada ninu ifọkansi GA ni SAM, bi o ti ṣe ni awọn gbongbo21. Pipin aaye ti igbohunsafẹfẹ imuṣiṣẹ nlsGPS1 ṣe afihan awọn ipele GA kekere diẹ ninu awọn ipele ita ti SAM, ṣugbọn fihan pe wọn gbega ni aarin ati ni awọn aala ti SAM (Fig. 4e ati Apọju 9a,c). Eyi ṣe imọran pe GA tun pin ni SAM pẹlu apẹrẹ aye ti o ṣe afiwe si eyiti o ṣafihan nipasẹ qmRGA. Gẹgẹbi ọna ibaramu, a tun tọju SAM pẹlu fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) tabi Fl nikan bi iṣakoso odi. A pin ifihan agbara Fl jakejado SAM, pẹlu agbegbe aarin ati primordium, botilẹjẹpe ni iwọn kekere (Fig. 4j ati Aworan Apọju. 10d). Ni idakeji, gbogbo awọn GA-Fl mẹta ti kojọpọ ni pato laarin awọn aala akọkọ ati si awọn iwọn ti o yatọ ni iyoku IPR, pẹlu GA7-Fl ti n ṣajọpọ ni agbegbe ti o tobi julọ ni IPR (Fig. 4k ati Apọju 10a, b). Pipin kikankikan fluorescence fi han pe IPR si ipin kikankikan ti kii-IPR ti ga julọ ni GA-Fl-itọju SAM ni akawe si SAM ti a ṣe itọju Fl (Fig. 4l ati Aworan Apọju. 10c). Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe GA wa ni awọn ifọkansi ti o ga julọ ni awọn sẹẹli IPR ti o wa nitosi aala eto ara eniyan. Eyi ṣe imọran pe apẹẹrẹ ti iṣẹ ifihan ifihan SAM GA lati inu ikosile iyatọ mejeeji ti awọn olugba GA ati ikojọpọ iyatọ ti GA ni awọn sẹẹli IPR nitosi awọn aala eto ara. Nitorinaa, itupalẹ wa ṣe afihan ilana spatiotemporal airotẹlẹ ti ifihan GA, pẹlu iṣẹ ṣiṣe kekere ni aarin ati primordium ti SAM ati iṣẹ ṣiṣe ti o ga julọ ni IPR ni agbegbe agbeegbe.
Lati loye ipa ti iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ti o yatọ ni SAM, a ṣe atupale ibamu laarin iṣẹ ifihan GA, imugboroja sẹẹli, ati pipin sẹẹli nipa lilo aworan akoko gidi-akoko ti SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Fi fun ipa ti GA ni ilana idagbasoke, ibamu rere pẹlu awọn aye imugboroja sẹẹli ni a nireti. Nitorinaa, a kọkọ ṣe afiwe awọn maapu iṣẹ ifihan ifihan GA pẹlu awọn maapu ti oṣuwọn idagbasoke dada sẹẹli (gẹgẹbi aṣoju fun agbara imugboroja sẹẹli fun sẹẹli ti a fun ati fun awọn sẹẹli ọmọbirin ni pipin) ati pẹlu awọn maapu ti anisotropy idagba, eyiti o ṣe iwọn itọsọna ti imugboroja sẹẹli (tun lo nibi fun sẹẹli ti a fun ati fun awọn sẹẹli ọmọbirin ni pipin; Fig. 5a,b, wo Awọn ọna ati Awọn ọna Afikun). Awọn maapu wa ti SAM cell dada idagbasoke oṣuwọn ni ibamu pẹlu awọn akiyesi ti tẹlẹ38,39, pẹlu awọn oṣuwọn idagbasoke ti o kere ju ni aala ati awọn oṣuwọn idagbasoke ti o pọju ni awọn ododo ti o ndagbasoke (Fig. 5a). Onínọmbà paati akọkọ (PCA) fihan pe iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ti ni ibatan ni odi pẹlu kikankikan idagbasoke dada sẹẹli (Figure 5c). A tun fihan pe awọn aake akọkọ ti iyatọ, pẹlu ifihan ifihan GA ati kikankikan idagbasoke, jẹ orthogonal si itọsọna ti a pinnu nipasẹ ikosile giga CLV3, ti o jẹrisi imukuro awọn sẹẹli lati ile-iṣẹ SAM ni awọn itupalẹ ti o ku. Iṣiro ibamu Spearman jẹrisi awọn abajade PCA (Nọmba 5d), ti o nfihan pe awọn ifihan agbara GA ti o ga julọ ni IPR ko ja si imugboroja sẹẹli ti o ga julọ. Bibẹẹkọ, itupalẹ ibamu ṣe afihan isọdọkan rere diẹ laarin iṣẹ ami ifihan GA ati anisotropy idagbasoke (Figure 5c, d), ni iyanju pe ifihan GA ti o ga julọ ni IPR ni ipa lori itọsọna ti idagbasoke sẹẹli ati o ṣee ṣe ipo ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli.
a, b Awọn maapu gbigbona ti idagbasoke dada (a) ati idagbasoke anisotropy (b) ni SAM ni aropin lori awọn ohun ọgbin ominira meje (ti a lo bi awọn aṣoju fun agbara ati itọsọna ti imugboroosi sẹẹli, lẹsẹsẹ). Iwadi c PCA pẹlu awọn oniyipada wọnyi: ifihan GA, kikankikan idagbasoke dada, anisotropy idagbasoke dada, ati ikosile CLV3. PCA paati 1 ni pataki ni ibamu pẹlu odi pẹlu kikankikan idagbasoke dada ati ni ibamu daadaa pẹlu ifihan GA. PCA paati 2 ni pataki ni ibamu daadaa pẹlu anisotropy idagba dada ati ni ibamu pẹlu odi pẹlu ikosile CLV3. Awọn ipin ogorun ṣe afihan iyatọ ti a ṣe alaye nipasẹ paati kọọkan. d Iṣiro ibamu Spearman laarin ifihan GA, kikankikan idagbasoke dada, ati anisotropy idagbasoke dada ni iwọn àsopọ laisi CZ. Nọmba ti o wa ni apa ọtun ni iye Spearman rho laarin awọn oniyipada meji. Asterisks tọka si awọn ọran nibiti isọdọkan/ibaramu odi jẹ pataki pupọ. e 3D iworan ti Col-0 SAM L1 ẹyin nipasẹ confocal maikirosikopu. Awọn odi sẹẹli titun ti a ṣẹda ni SAM (ṣugbọn kii ṣe primordium) ni wakati 10 jẹ awọ ni ibamu si awọn iye igun wọn. Pẹpẹ awọ ti han ni igun apa ọtun isalẹ. Inset fihan aworan 3D ti o baamu ni 0 wakati. Awọn ṣàdánwò ti a tun lemeji pẹlu iru esi. f Awọn igbero apoti ṣe afihan awọn oṣuwọn pipin sẹẹli ni IPR ati ti kii ṣe IPR Col-0 SAM (n = 10 awọn ohun ọgbin ominira). Laini aarin fihan agbedemeji, ati awọn aala apoti tọkasi awọn ipin 25th ati 75th. Whiskers tọkasi o kere julọ ati awọn iye ti o pọju ti pinnu pẹlu sọfitiwia R. Awọn iye P ni a gba pẹlu idanwo t-tailed meji ti Welch. g, h Aworan atọka ti o nfihan (g) bawo ni a ṣe le wiwọn igun ti ogiri sẹẹli tuntun (magenta) pẹlu ọwọ si itọsọna radial lati aarin ti SAM (ila ti aami funfun) (awọn iye igun igun nikan, ie, 0–90 °, ni a gbero), ati (h) awọn iyipo / ita ati awọn itọnisọna radial laarin meristem. i Awọn itan-akọọlẹ igbohunsafẹfẹ ti iṣalaye ọkọ ofurufu pipin sẹẹli kọja SAM (buluu dudu), IPR (buluu alabọde), ati ti kii ṣe IPR (buluu ina), lẹsẹsẹ. Awọn iye P ni a gba nipasẹ idanwo meji-tailed Kolmogorov-Smirnov. Awọn ṣàdánwò ti a tun lemeji pẹlu iru esi. j Awọn itan-akọọlẹ igbohunsafẹfẹ ti iṣalaye ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ti IPR ni ayika P3 (alawọ ewe ina), P4 (alawọ ewe alabọde), ati P5 (alawọ ewe dudu), lẹsẹsẹ. Awọn iye P ni a gba nipasẹ idanwo meji-tailed Kolmogorov-Smirnov. Awọn ṣàdánwò ti a tun lemeji pẹlu iru esi.
Nitorinaa, a ṣe iwadii atẹle ni ibamu laarin ifihan ifihan GA ati iṣẹ pipin sẹẹli nipa idamọ awọn odi sẹẹli tuntun ti a ṣẹda lakoko idanwo (Fig. 5e). Ọna yii gba wa laaye lati wiwọn igbohunsafẹfẹ ati itọsọna ti pipin sẹẹli. Iyalenu, a rii pe igbohunsafẹfẹ ti awọn ipin sẹẹli ni IPR ati iyokù SAM (ti kii ṣe IPR, Fig. 5f) jẹ iru, ti o fihan pe awọn iyatọ ninu ifihan ifihan GA laarin IPR ati awọn sẹẹli ti kii-IPR ko ni ipa pataki pipin sẹẹli. Eyi, ati ibaramu rere laarin ifihan ifihan GA ati anisotropy idagba, jẹ ki a gbero boya iṣẹ ṣiṣe ifihan GA le ni ipa ni iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli. A ṣe iwọn iṣalaye ti ogiri sẹẹli tuntun bi igun nla ti o ni ibatan si radial axis ti o so ile-iṣẹ meristem ati aarin ti ogiri sẹẹli titun (Fig. 5e-i) ati ki o ṣe akiyesi ifarahan ti o han gbangba fun awọn sẹẹli lati pin ni awọn igun ti o sunmọ 90 ° ojulumo si radial axis, pẹlu awọn igbohunsafẹfẹ ti o ga julọ ti a ṣe akiyesi ni 70-82-8% 23 ° (23) ati 70-82%) (23). (Fig. 5e, i), ti o ni ibamu si awọn pipin sẹẹli ni agbegbe iyipo / iyipada (Fig. 5h). Lati ṣe ayẹwo idasi ti ifihan ifihan GA si ihuwasi pipin sẹẹli yii, a ṣe atupale awọn ipin pipin sẹẹli ni IPR ati ti kii ṣe IPR lọtọ (Fig. 5i). A ṣe akiyesi pe pinpin igun pipin ni awọn sẹẹli IPR yatọ si pe ninu awọn sẹẹli ti kii ṣe IPR tabi ni awọn sẹẹli ni gbogbo SAM, pẹlu awọn sẹẹli IPR ti o ṣe afihan awọn ipin ti o ga julọ ti awọn ẹgbẹ ti ita / ipin-ipin, ie, 70-80 ° ati 80-90 ° (33.86% ati 30.71%, lẹsẹsẹ, awọn ipele ti o baamu) (Fig.5). Nitorinaa, awọn akiyesi wa ṣe afihan ajọṣepọ kan laarin ifihan ifihan GA giga ati iṣalaye ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ti o sunmọ si itọsọna yipo, iru si ibamu laarin iṣẹ ifihan GA ati anisotropy idagbasoke (Fig. 5c, d). Lati ṣe agbekalẹ itọju aaye ti ẹgbẹ yii siwaju, a ṣe iwọn iṣalaye ọkọ ofurufu pipin ni awọn sẹẹli IPR ti o yika primordium ti o bẹrẹ lati P3, niwọn bi a ti rii iṣẹ ami ifihan GA ti o ga julọ ni agbegbe yii ti o bẹrẹ lati P4 (Fig. 4). Awọn igun pipin ti IPR ti o wa ni ayika P3 ati P4 ko ṣe afihan awọn iyatọ ti o pọju ti iṣiro, biotilejepe a ṣe akiyesi igbohunsafẹfẹ ti o pọju ti awọn ipin sẹẹli ti ita ni IPR ni ayika P4 (Fig. 5j). Sibẹsibẹ, ninu awọn sẹẹli IPR ti o wa ni ayika P5, iyatọ ninu iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli di iṣiro pataki, pẹlu ilosoke didasilẹ ni igbohunsafẹfẹ ti awọn ipin sẹẹli ti o kọja (Fig. 5j). Papọ, awọn abajade wọnyi daba pe ifihan ifihan GA le ṣakoso iṣalaye ti awọn ipin sẹẹli ni SAM, eyiti o ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju40,41 pe ifihan GA giga le fa iṣalaye ita ti awọn ipin sẹẹli ni IPR.
O jẹ asọtẹlẹ pe awọn sẹẹli ti o wa ninu IPR kii yoo dapọ si primordia ṣugbọn dipo sinu internodes2,42,43. Iṣalaye ifapa ti awọn ipin sẹẹli ni IPR le ja si ni eto aṣoju ti awọn ila gigun ti awọn sẹẹli epidermal ni awọn internodes. Awọn akiyesi wa ti a ṣalaye loke daba pe ifihan ifihan GA le ṣe ipa kan ninu ilana yii nipa ṣiṣe ilana itọsọna ti pipin sẹẹli.
Pipadanu iṣẹ ti ọpọlọpọ awọn Jiini DELLA ni abajade idahun GA kan, ati pe awọn mutanti della le ṣee lo lati ṣe idanwo ile-aye44 yii. A kọkọ ṣe atupale awọn ilana ikosile ti awọn Jiini DELLA marun ninu SAM. Ijọpọ transcriptional ti GUS line45 fi han pe GAI, RGA, RGL1, ati RGL2 (si iwọn ti o kere pupọ) ni a fihan ni SAM (Afikun Afikun. 11a-d). Ni ipo arabara arabara siwaju fihan pe GAI mRNA kojọpọ pataki ni primordia ati idagbasoke awọn ododo (Afikun 11e). RGL1 ati RGL3 mRNA ni a rii jakejado ibori SAM ati ni awọn ododo ti o dagba, lakoko ti RGL2 mRNA pọ si ni agbegbe aala (Afikun. 11f–h). Aworan confocal ti pRGL3 :: RGL3-GFP SAM jẹrisi ikosile ti a ṣe akiyesi nipasẹ isọdọkan ipo ati fihan pe amuaradagba RGL3 kojọpọ ni apakan aarin ti SAM (Afikun Fig. 11i). Lilo pRGA :: GFP-RGA laini, a tun rii pe amuaradagba RGA kojọpọ ni SAM, ṣugbọn opo rẹ dinku ni aala ti o bẹrẹ lati P4 (Afikun 11j). Ni pataki, awọn ilana ikosile ti RGL3 ati RGA ni ibamu pẹlu iṣẹ ami ifihan GA ti o ga julọ ni IPR, bi a ti rii nipasẹ qmRGA (Fig. 4). Pẹlupẹlu, data wọnyi fihan pe gbogbo awọn DELLA ni a fihan ni SAM ati pe ikosile wọn ni apapọ ni gbogbo SAM.
Nigbamii ti a ṣe atupale awọn paramita pipin sẹẹli ni iru SAM (Ler, iṣakoso) ati gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (agbaye) mutanti (Fig. 6a, b). O yanilenu, a ṣe akiyesi iyipada ti o ṣe pataki ni iṣiro ni pinpin awọn igbohunsafẹfẹ igun pipin sẹẹli ni della mutant SAM ni akawe si iru egan (Fig. 6c). Iyipada yii ni iyipada agbaye ti della jẹ nitori ilosoke ninu igbohunsafẹfẹ ti awọn igun 80-90 ° (34.71% vs. 24.55%) ati, si iwọn diẹ, awọn igun 70-80 ° (23.78% vs. 20.18%), ie, ti o baamu si awọn ipin sẹẹli transverse (Fig. 6c). Awọn igbohunsafẹfẹ ti awọn ipin ti kii ṣe iyipada (0-60 °) tun wa ni isalẹ ni ẹda agbaye della (Fig. 6c). Igbohunsafẹfẹ ti awọn ipin sẹẹli ifapa ti pọ si ni pataki ni SAM ti mutanti agbaye della (Fig. 6b). Igbohunsafẹfẹ awọn ipin sẹẹli ifapa ninu IPR tun ga julọ ni ẹda agbaye della ni akawe si iru egan (Fig. 6d). Ni ita agbegbe IPR, iru egan ni pinpin iṣọkan diẹ sii ti awọn igun pipin sẹẹli, lakoko ti della mutant agbaye fẹ awọn ipin tangential bii IPR (Fig. 6e). A tun ṣe iwọn iṣalaye ti awọn ipin sẹẹli ni SAM ti ga2 oxidase (ga2ox) awọn ẹda quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ati ga2ox6-2), ipilẹ ẹda GA-aictive ninu eyiti GA kojọpọ. Ni ibamu pẹlu ilosoke ninu awọn ipele GA, SAM ti quintuple ga2ox mutant inflorescence ti o tobi ju ti Col-0 (Afikun Fig. 12a, b), ati ni akawe si Col-0, quintuple ga2ox SAM ṣe afihan pinpin iyatọ ti o yatọ ti awọn igun pipin sẹẹli, pẹlu iwọn ilawọn ti o pọ si lati 50 ° gentẹlẹfẹfẹfẹfẹ lẹẹkansii si 9. aworan 12a–c). Nitorinaa, a fihan pe imuṣiṣẹ adaṣe ti ifihan ifihan GA ati ikojọpọ GA jẹ ki awọn ipin sẹẹli ti ita ni IPR ati iyoku SAM.
a, b 3D iworan ti L1 Layer ti PI-abariwon Ler (a) ati agbaye della mutant (b) SAM lilo confocal maikirosikopu. Awọn odi sẹẹli titun ti a ṣẹda ni SAM (ṣugbọn kii ṣe primordium) lori akoko 10-h ti han ati awọ ni ibamu si awọn iye igun wọn. Awọn inset fihan SAM ni 0 wakati. Pẹpẹ awọ ti han ni igun apa ọtun isalẹ. Ọfà ti o wa ninu (b) tọka si apẹẹrẹ ti awọn faili sẹẹli ti o ni ibamu ninu ẹda della agbaye. Awọn ṣàdánwò ti a tun lemeji pẹlu iru esi. ce lafiwe ti awọn igbohunsafẹfẹ pinpin sẹẹli pipin awọn itọnisọna ofurufu ni gbogbo SAM (d), IPR (e), ati ti kii-IPR (f) laarin Ler ati agbaye della. Awọn iye P ni a gba ni lilo idanwo meji-tailed Kolmogorov-Smirnov. f, g 3D iworan ti confocal awọn aworan ti PI-abariwon SAM of Col-0 (i) ati pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgenic eweko. Awọn panẹli (a, b) ṣe afihan awọn odi sẹẹli tuntun (ṣugbọn kii ṣe primordia) ti a ṣẹda ninu SAM laarin awọn wakati 10. Awọn ṣàdánwò ti a tun lemeji pẹlu iru esi. h–j Ifiwera pinpin igbohunsafẹfẹ ti awọn itọnisọna ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ti o wa ni gbogbo SAM (h), IPR (i) ati kii ṣe IPR (j) laarin awọn ohun ọgbin Col-0 ati pCUC2 :: gai-1-VENUS. Awọn iye P ni a gba ni lilo idanwo meji-tailed Kolmogorov-Smirnov.
Nigbamii ti a ṣe idanwo ipa ti idinamọ ifihan GA ni pataki ni IPR. Ni ipari yii, a lo olupolowo ago cotyledon 2 (CUC2) lati wakọ ikosile ti amuaradagba gai-1 odi ti o dapọ si VENUS (ni pCUC2 :: gai-1-VENUS laini). Ninu SAM-iru egan, olupolowo CUC2 n ṣakoso ikosile ti ọpọlọpọ awọn IPR ni SAM, pẹlu awọn sẹẹli aala, lati P4 siwaju, ati iru ikosile kan pato ni a ṣe akiyesi ni pCUC2 :: gai-1-VENUS eweko (wo isalẹ). Pipin awọn igun pipin sẹẹli kọja SAM tabi IPR ti pCUC2 :: gai-1-VENUS eweko ko yatọ si ti iru egan, botilẹjẹpe lairotẹlẹ a rii pe awọn sẹẹli laisi IPR ninu awọn irugbin wọnyi pin ni igbohunsafẹfẹ giga ti 80-90 ° (Fig. 6f – j).
A ti daba pe itọsọna ti pipin sẹẹli da lori geometry ti SAM, ni pataki aapọn fifẹ ti ipilẹṣẹ nipasẹ curvature tissue46. Nitorina a beere boya apẹrẹ ti SAM ti yipada ni della agbaye mutant ati pCUC2 :: gai-1-VENUS eweko. Gẹgẹbi a ti sọ tẹlẹ12, iwọn ti della mutant SAM ti o tobi ju ti iru egan lọ (Afikun 13a, b, d). Ni isọdi ipo ti CLV3 ati STM RNA jẹrisi imugboroja meristem ni awọn ẹda della ati siwaju sii ṣafihan imugboroja ita ti onakan sẹẹli stem (Afikun. 13e, f, h, i). Bibẹẹkọ, ìsépo SAM jẹ iru ni awọn genotypes mejeeji (Ọpọtọ Afikun. 13k, m, n, p). A ṣe akiyesi iru ilosoke ninu iwọn gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant laisi iyipada ninu ìsépo ti a fiwewe si iru egan (Afikun Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Igbohunsafẹfẹ ti iṣalaye pipin sẹẹli tun ni ipa ninu mutant della quadruple, ṣugbọn si iwọn ti o kere ju ninu mutant monolithic della (Eyaworan afikun. 12d-f). Ipa iwọn lilo yii, pẹlu aini ipa lori ìsépo, ni imọran pe iṣẹku RGL3 ti o ku ninu Della quadruple mutant fi opin si awọn iyipada ni iṣalaye pipin sẹẹli ti o ṣẹlẹ nipasẹ isonu ti iṣẹ DELLA ati pe awọn iyipada ninu awọn ipin sẹẹli ita waye ni idahun si awọn iyipada ninu iṣẹ ami ifihan GA ju awọn iyipada ninu geometry SAM. Gẹgẹbi a ti ṣalaye loke, olupolowo CUC2 n ṣe awakọ ikosile IPR ni SAM ti o bẹrẹ ni P4 (Afikun Fig. 14a, b), ati ni idakeji, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM ni iwọn ti o dinku ṣugbọn curvature ti o ga julọ (Eya afikun 14c – h). Iyipada yii ni pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology le ja si pinpin oriṣiriṣi awọn aapọn ẹrọ ni akawe si iru egan, ninu eyiti awọn aapọn iyipo giga bẹrẹ ni ijinna kukuru lati SAM center47. Ni omiiran, awọn iyipada ninu pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology le ja lati awọn iyipada ninu awọn ohun-ini ẹrọ agbegbe ti o fa nipasẹ transgene expression48. Ni awọn ọran mejeeji, eyi le ṣe aiṣedeede awọn ipa ti awọn ayipada ninu ifihan ifihan GA nipa jijẹ iṣeeṣe ti awọn sẹẹli yoo pin ni iṣalaye iyipo / iṣipopada, n ṣalaye awọn akiyesi wa.
Papọ, data wa jẹrisi pe ifihan GA ti o ga julọ ṣe ipa ti nṣiṣe lọwọ ni iṣalaye ita ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ni IPR. Wọn tun fihan pe ìsépo meristem tun ni ipa lori iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ni IPR.
Iṣalaye iyipada ti ọkọ ofurufu pipin ni IPR, nitori iṣẹ ami ifihan GA ti o ga, ni imọran pe GA ṣaju-ṣeto faili sẹẹli radial kan ninu epidermis laarin SAM lati ṣalaye agbari cellular ti yoo rii nigbamii ni internode epidermal. Nitootọ, iru awọn faili sẹẹli ni igbagbogbo han ni awọn aworan SAM ti della mutanti agbaye (Fig. 6b). Bayi, lati ṣawari siwaju sii iṣẹ idagbasoke ti ilana aaye ti ifihan ifihan GA ni SAM, a lo awọn aworan ti o ni akoko-akoko lati ṣe itupalẹ iṣeto ti agbegbe ti awọn sẹẹli ni IPR ni iru egan (Ler ati Col-0), della mutants agbaye, ati pCUC2 :: gai-1-VENUS transgenic eweko.
A rii pe qmRGA fihan pe iṣẹ ifihan ifihan GA ni IPR pọ si lati P1/P2 ati peaked ni P4, ati pe apẹẹrẹ yii wa ni igbagbogbo ni akoko pupọ (Eeya. Lati ṣe itupalẹ iṣeto aye ti awọn sẹẹli ni IPR pẹlu ifihan GA ti o pọ si, a ṣe aami awọn sẹẹli Ler IPR loke ati si awọn ẹgbẹ ti P4 ni ibamu si ayanmọ idagbasoke wọn ti a ṣe atupale 34 h lẹhin akiyesi akọkọ, ie, diẹ sii ju awọn akoko plastid meji, gbigba wa laaye lati tẹle awọn sẹẹli IPR lakoko idagbasoke primordium lati P1 / P2 si P4. A lo awọn awọ mẹta ti o yatọ: ofeefee fun awọn sẹẹli ti a fi sinu primordium nitosi P4, alawọ ewe fun awọn ti o wa ni IPR, ati eleyi ti fun awọn ti o ṣe alabapin ninu awọn ilana mejeeji (Fig. 7a-c). Ni t0 (0 h), awọn ipele 1-2 ti awọn sẹẹli IPR ti han ni iwaju P4 (Fig. 7a). Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, nigbati awọn sẹẹli wọnyi pin, wọn ṣe ni pataki nipasẹ ọkọ ofurufu pipin iṣipopada (Figs. 7a-c). Awọn abajade ti o jọra ni a gba ni lilo Col-0 SAM (fifojusi lori P3, eyiti aala rẹ ṣe pọ si P4 ni Ler), botilẹjẹpe ninu genotype yii agbo ti a ṣẹda ni aala ododo ti tọju awọn sẹẹli IPR ni iyara (Fig. 7g-i). Nitorinaa, ilana pipin ti awọn sẹẹli IPR ṣaju-ṣeto awọn sẹẹli sinu awọn ori ila radial, bi ninu awọn internodes. Eto ti awọn ori ila radial ati isọdi ti awọn sẹẹli IPR laarin awọn ara ti o tẹle ni imọran pe awọn sẹẹli wọnyi jẹ progenitors internodal.
Nibi, a ṣe agbekalẹ biosensor ifihan agbara ratiometric GA, qmRGA, ti o ngbanilaaye aworan atọka iwọn ti iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ti o waye lati apapọ GA ati awọn ifọkansi olugba GA lakoko ti o dinku kikọlu pẹlu awọn ipa ọna ifihan agbara, nitorinaa pese alaye lori iṣẹ GA ni ipele cellular. Ni ipari yii, a ṣe amuaradagba DELLA ti a ṣe atunṣe, mRGA, ti o padanu agbara lati di awọn alabaṣiṣẹpọ ibaraenisepo DELLA ṣugbọn o jẹ ifarabalẹ si proteolysis ti GA-induced. qmRGA ṣe idahun si awọn iyipada nla ati ailopin ni awọn ipele GA, ati awọn ohun-ini oye ti o ni agbara jẹ ki iṣiroye awọn ayipada aye-aye ni iṣẹ ami ifihan GA lakoko idagbasoke. qmRGA tun jẹ ohun elo ti o ni irọrun pupọ bi o ṣe le ṣe deede si awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi nipa yiyipada olupolowo ti a lo fun ikosile rẹ (ti o ba jẹ dandan), ati fun iseda ti o tọju ti ọna ifihan GA ati ero PFYRE kọja angiosperms, o ṣee ṣe lati gbe lọ si awọn eya miiran22. Ni ibamu pẹlu eyi, iyipada deede kan ninu amuaradagba iresi SLR1 DELLA (HYY497AAA) tun han lati dinku iṣẹ-ṣiṣe imupadabọ idagbasoke ti SLR1 lakoko ti o dinku idinku ibaje-aladede GA rẹ, iru si mRGA23. Ni pataki, awọn iwadii aipẹ ni Arabidopsis fihan pe iyipada amino acid kan ni agbegbe PFYRE (S474L) ṣe iyipada iṣẹ ṣiṣe transcription ti RGA laisi ni ipa lori agbara rẹ lati ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn alabaṣiṣẹpọ ifosiwewe transcription50. Botilẹjẹpe iyipada yii sunmo pupọ si awọn aropo amino acid 3 ti o wa ninu mRGA, awọn ijinlẹ wa fihan pe awọn iyipada meji wọnyi paarọ awọn abuda pato ti DELLA. Botilẹjẹpe ọpọlọpọ awọn alabaṣiṣẹpọ ifosiwewe transcription sopọ mọ LHR1 ati awọn agbegbe SAW ti DELLA26,51, diẹ ninu awọn amino acids ti a fipamọ ni agbegbe PFYRE le ṣe iranlọwọ lati mu awọn ibaraṣepọ wọnyi duro.
Idagbasoke Internode jẹ ami pataki ninu faaji ọgbin ati ilọsiwaju ikore. qmRGA ṣe afihan iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ti o ga julọ ninu awọn sẹẹli progenitor internode IPR. Nipa pipọ awọn aworan pipo ati awọn Jiini, a fihan pe awọn ilana ifihan GA superimpose awọn ọkọ ofurufu pipin ipin sẹẹli / transverse ninu SAM epidermis, ti n ṣe agbekalẹ eto pipin sẹẹli ti o nilo fun idagbasoke internode. Ọpọlọpọ awọn olutọsọna ti iṣalaye ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ni a ti ṣe idanimọ lakoko idagbasoke52,53. Iṣẹ wa n pese apẹẹrẹ ti o han gbangba ti bii iṣẹ ṣiṣe ifihan GA ṣe n ṣe ilana paramita cellular yii. DELLA le ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn eka amuaradagba iṣaju iṣaju41, nitorinaa ifihan GA le ṣe ilana iṣalaye pipin sẹẹli nipasẹ ni ipa taara cortical microtubule orientation40,41,54,55. A ṣe afihan lairotẹlẹ pe ni SAM, atunṣe ti iṣẹ ami ifihan GA ti o ga julọ kii ṣe elongation tabi pipin sẹẹli, ṣugbọn anisotropy idagba nikan, eyiti o ni ibamu pẹlu ipa taara ti GA lori itọsọna ti pipin sẹẹli ni IPR. Bibẹẹkọ, a ko le yọkuro pe ipa yii tun le jẹ aiṣe-taara, fun apẹẹrẹ alaja nipasẹ rirọ ogiri sẹẹli ti GA-induced56. Awọn iyipada ninu awọn ohun-ini ogiri sẹẹli jẹ ki wahala ẹrọ ṣiṣẹ57,58, eyiti o tun le ni ipa ni iṣalaye ti ọkọ ofurufu pipin sẹẹli nipa ni ipa iṣalaye ti awọn microtubules cortical39,46,59. Awọn ipa apapọ ti GA-induced darí aapọn ati ilana taara ti microtubule Iṣalaye nipa GA le wa ni lowo ninu ti o npese kan pato Àpẹẹrẹ ti sẹẹli pipinka ni IPR lati setumo internodes, ati siwaju sii iwadi wa ni ti nilo lati se idanwo yi agutan. Bakanna, awọn ijinlẹ iṣaaju ti ṣe afihan pataki ti awọn ọlọjẹ DELLA-ibarapọ TCP14 ati 15 ni iṣakoso ti iṣelọpọ internode60,61 ati awọn nkan wọnyi le ṣe agbedemeji iṣẹ ti GA papọ pẹlu BREVIPEDICELLUS (BP) ati PENNYWISE (PNY), eyiti o ṣe ilana idagbasoke internode ati ti fihan lati ni ipa GA signaling2,62. Fun pe awọn DELLA ṣe ajọṣepọ pẹlu brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ati abscisic acid (ABA) awọn ipa ọna ifihan agbara63,64 ati pe awọn homonu wọnyi le ni ipa lori iṣalaye microtubule65, awọn ipa ti GA lori iṣalaye pipin sẹẹli le tun jẹ agbedemeji nipasẹ awọn homonu miiran.
Awọn ijinlẹ cytological ni kutukutu fihan pe awọn agbegbe inu ati ita ti Arabidopsis SAM ni a nilo fun idagbasoke internode2,42. Otitọ pe GA ni itara ṣe ilana pipin sẹẹli ni awọn tissues ti inu12 ṣe atilẹyin iṣẹ meji ti GA ni ṣiṣakoso meristem ati iwọn internode ni SAM. Apẹrẹ ti pipin sẹẹli itọsọna tun jẹ ofin ni wiwọ ninu awọ ara SAM ti inu, ati pe ilana yii ṣe pataki fun idagbasoke yio52. Yoo jẹ ohun ti o nifẹ lati ṣe ayẹwo boya GA tun ṣe ipa kan ni iṣalaye ọkọ ofurufu pipin sẹẹli ninu agbari SAM ti inu, nitorinaa mimuuṣiṣẹpọ sipesifikesonu ati idagbasoke awọn internodes laarin SAM.
Awọn ohun ọgbin ti dagba ni vitro ni ile tabi 1x Murshige-Skoog (MS) alabọde (Duchefa) ni afikun pẹlu 1% sucrose ati 1% agar (Sigma) labẹ awọn ipo boṣewa (ina 16 h, 22 ° C), ayafi fun hypocotyl ati awọn idanwo idagbasoke root ninu eyiti awọn irugbin dagba lori awọn awo inaro labẹ ina igbagbogbo ati 22 °C. Fun awọn adanwo iyọ, awọn ohun ọgbin ti dagba lori alabọde MS ti a ti yipada (alabọde ọgbin bioWORLD) ni afikun pẹlu iyọ deede (0 tabi 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ati 1% A-agar (Sigma) labẹ awọn ipo ọjọ-gigun.
GID1a cDNA ti a fi sii sinu pDONR221 ni a tun darapọ pẹlu pDONR P4-P1R-pUBQ10 ati pDONR P2R-P3-mCherry sinu pB7m34GW lati ṣe ipilẹṣẹ pUBQ10 :: GID1a-mCherry. IDD2 DNA ti a fi sii sinu pDONR221 ni a tun darapọ sinu pB7RWG266 lati ṣe ipilẹṣẹ p35S: IDD2-RFP. Lati ṣe ipilẹṣẹ pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, ajẹkù 3.9 kb kan ni oke ti agbegbe ifaminsi GID1b ati ajẹkù 4.7 kb kan ti o ni GID1b cDNA (1.3 kb) ati terminator (3.4 kb) ni akọkọ ti pọ si ni lilo awọn alakoko ni Afikun Table 3 ati lẹhinna R fi sii P1P Fisher Scientific) ati pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), lẹsẹsẹ, ati nipari recombined pẹlu pDONR221 2xmTQ268 sinu pGreen 012567 afojusun fekito lilo Gateway cloning. Lati ṣe agbejade pCUC2 :: LSSmOrange, ilana olupolowo CUC2 (3229 bp ni oke ti ATG) atẹle nipasẹ ọna ifaminsi ti Stokes-shifted mOrange nla (LSSmOrange) 69 pẹlu ami isọdi agbegbe iparun N7 ati NOS transcriptional terminator ni a pejọ sinu pGreen vegany-apejuwe kanmy3. eto atunko (Invitrogen). A ṣe afihan fekito alakomeji ọgbin sinu Agrobacterium tumefaciens igara GV3101 ati ṣafihan sinu Nicotiana benthamiana leaves nipasẹ ọna infiltration Agrobacterium ati sinu Arabidopsis thaliana Col-0 nipasẹ ọna dip ododo, lẹsẹsẹ. pUBQ10 ::qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry ati pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA ni a ya sọtọ si awọn ọmọ-ọmọ F3 ati F1 ti awọn agbelebu oniwun, lẹsẹsẹ.
RNA ni ipo arabara ni a ṣe lori isunmọ 1 cm gigun awọn imọran iyaworan72, eyiti a gba ati ti o wa titi lẹsẹkẹsẹ ni ojutu FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) tutu-tutu si 4 °C. Lẹhin awọn itọju igbale 2 × 15 min, atunṣe ti yipada ati pe awọn ayẹwo ti wa ni abẹla ni alẹ kan. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ati cDNAs RGL3 ati awọn iwadii antisense si 3'-UTRs ni a ṣepọ pẹlu lilo awọn alakoko ti o han ni Tabili Imudara 3 gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Rosier et al.73. Awọn iwadii ti o ni aami-digoxigenin jẹ ajẹsara nipa lilo awọn ajẹsara digoxigenin (dilution-fold dilution; Roche, nọmba katalogi: 11 093 274 910), ati awọn apakan ti a ni abawọn pẹlu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250etrobt) 200-agbo fomipo) ojutu.
Akoko ifiweranṣẹ: Kínní-10-2025