Oògùn anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ni a ti royin pe o dẹkun AChE (acetylcholinesterase) o si ni awọn agbara ti o le fa arun inu nitori isọdi iṣan ara ti o pọ ju. Ninu iwe yii, a fihan pe DEET ni pataki n ru awọn sẹẹli endothelial soke ti o n gbe angiogenesis soke, nitorinaa o n mu idagbasoke tumo pọ si. DEET n mu awọn ilana sẹẹli ṣiṣẹ ti o yori si angiogenesis, pẹlu ilosoke, iṣipopada, ati adhesion. Eyi ni nkan ṣe pẹlu ilosoke iṣelọpọ NO ati ifihan VEGF ninu awọn sẹẹli endothelial. Didẹkun M3 tabi lilo awọn inhibitors M3 oogun pa gbogbo awọn ipa wọnyi run, ni imọran pe angiogenesis ti DEET fa jẹ ifamọra M3. Awọn idanwo ti o ni ibatan si ifihan calcium ninu awọn sẹẹli endothelial ati HEK ti o n ṣafihan pupọju awọn olugba M3, ati awọn ẹkọ binding ati docking, fihan pe DEET n ṣiṣẹ gẹgẹbi modulator allosteric ti awọn olugba M3. Pẹlupẹlu, DEET n ṣe idiwọ AChE, nitorinaa o n mu bioavailability ti acetylcholine ati isopọ rẹ si awọn olugba M3 pọ si, ati imudarasi awọn ipa proangiogenic nipasẹ ilana allosteric.
A ya àwọn EC àkọ́kọ́ sọ́tọ̀ kúrò nínú aorta àwọn eku Swiss. A ṣe àtúnṣe ọ̀nà yíyọ wọn láti inú ìlànà Kobayashi 26. A gbin àwọn EC Murine ní àárín EBM-2 pẹ̀lú 5% FBS tí kò ṣiṣẹ́ dáadáa títí di ìgbà kẹrin.
A ṣe àyẹ̀wò ipa ìfọ́pọ̀ DEET méjì lórí ìbísí HUVEC, U87MG, tàbí BF16F10 nípa lílo Ohun èlò Ìwádìí Ẹlẹ́ẹ̀kan CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Ní kúkúrú, a gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì 5.103 fún kànga kan nínú àwo 96 kan, a jẹ́ kí wọ́n so mọ́ ọn ní alẹ́, lẹ́yìn náà a fi DEET tọ́jú wọn fún wákàtí 24. Lẹ́yìn yíyọ ohun èlò ìdàgbàsókè kúrò, fi omi ìdènà àwọ̀ kún kànga kọ̀ọ̀kan ti microplate náà kí o sì fi àwọn sẹ́ẹ̀lì náà sínú rẹ̀ ní 37 °C fún ìṣẹ́jú 30. A pinnu ìwọ̀n fluorescence nípa lílo ohun èlò ìkàwé microplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) tí a fi àwọn àlẹ̀mọ́ ìtara 485 nm àti àwọn àlẹ̀mọ́ ìtújáde 530 nm.
A gbìn HUVEC sínú àwọn àwo 96 tí ó ní ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì 104 fún gbogbo kànga kan. A fi DEET tọ́jú àwọn sẹ́ẹ̀lì fún wákàtí 24. A ṣe àyẹ̀wò bí sẹ́ẹ̀lì ṣe lè ṣiṣẹ́ dáadáa nípa lílo àyẹ̀wò MTT aláwọ̀ (Sigma-Aldrich, M5655). A gba àwọn ìwọ̀n ìwúwo optíkì lórí ẹ̀rọ ìkàwé oní-ẹ̀rọ multimode (Mithras LB940) ní ìwọ̀n ìgbì 570 nm.
A ṣe ìwádìí nípa àwọn ipa DEET nípa lílo àwọn àyẹ̀wò in vitro angiogenesis. Ìtọ́jú pẹ̀lú 10-8 M tàbí 10-5 M DEET mú kí ìṣẹ̀dá gígùn capillary pọ̀ sí i nínú àwọn HUVEC (Àwòrán 1a, b, àwọn ọ̀pá funfun). Ní ìfiwéra pẹ̀lú ẹgbẹ́ ìṣàkóso, ìtọ́jú pẹ̀lú ìfọ́pọ̀ DEET láti 10-14 sí 10-5 M fihàn pé gígùn capillary dé ibi tí ó tẹ́jú ní 10-8 M DEET (Àfikún Àwòrán S2). Kò sí ìyàtọ̀ pàtàkì tí a rí nínú ipa proangiogenic in vitro ti àwọn HUVEC tí a fi DEET tọ́jú ní ìwọ̀n ìfọ́pọ̀ ti 10-8 M àti 10-5 M.
Láti mọ ipa ti DEET ní lórí neovascularization, a ṣe àwọn ìwádìí in vivo neovascularization. Lẹ́yìn ọjọ́ mẹ́rìnlá, a fi àwọn èkúté tí a fi DEET 10-8 M tàbí 10-5 M fún àwọn èkúté fi hàn pé iye hemoglobin wọn pọ̀ sí i (Àwòrán 1c, àwọn ọ̀pá funfun).
Síwájú sí i, a ṣe àyẹ̀wò neovascularization tí DEET fà nínú àwọn eku tí wọ́n ní xenograft U87MG tí wọ́n ń fún ní DEET lójoojúmọ́ (ip) ní ìwọ̀n tí a mọ̀ pé ó ń fa ìpele plasma ti 10-5 M, èyí tí ó jẹ́ déédé nínú àwọn ènìyàn tí wọ́n fara hàn. nínú 23. Àwọn èèmọ tí a lè rí (ìyẹn àwọn èèmọ tí ó ju 100 mm3 lọ) ni a rí ní ọjọ́ 14 lẹ́yìn abẹ́rẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì U87MG sínú àwọn eku. Ní ọjọ́ 28, ìdàgbàsókè èèmọ náà pọ̀ sí i ní àwọn eku tí a tọ́jú DEET ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn eku tí a ṣàkóso (Àwòrán 1d, àwọn onígun mẹ́rin). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìrísí àwọn èèmọ CD31 fihàn pé DEET mú kí agbègbè capillary pọ̀ sí i ní pàtàkì ṣùgbọ́n kì í ṣe ìwọ̀n microvessel. (Àwòrán 1e–g).
Láti mọ ipa ti awọn olugba muscarinic ninu idagbasoke ti DETA fa, a lo 10-8 M tabi 10-5 M DETA niwaju pFHHSiD (10-7 M, ayanmọ olugba M3 yiyan). Itọju HUVEC. pFHHSiD dina awọn ohun-ini itankale ti DETA patapata ni gbogbo awọn ifọkansi (Tabili 1).
Lábẹ́ àwọn ipò wọ̀nyí, a tún ṣe àyẹ̀wò bóyá DEET yóò mú kí gígùn capillary pọ̀ sí i nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì HUVEC. Bákan náà, pFHHSiD ṣe ìdènà gígùn capillary tí DEET fà ní pàtàkì (Àwòrán 1a, b, àwọn ọ̀pá grẹ́y). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a ṣe àwọn àyẹ̀wò kan náà pẹ̀lú M3 siRNA. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé siRNA ìṣàkóso kò múnádóko nínú gbígbé ìṣẹ̀dá capillary lárugẹ, pípa ẹnu mọ́ olugba muscarinic M3 pa agbára DEET láti mú kí gígùn capillary pọ̀ sí i (Àwòrán 1a, b, àwọn ọ̀pá dúdú).
Síwájú sí i, ìṣàn ẹ̀jẹ̀ tí DEET fa 10-8 M tàbí 10-5 M nínú vitro àti neovascularization nínú vivo ni pFHHSiD ti dí pátápátá (Àwòrán 1c, d, circles). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fihàn pé DEET ń gbé angiogenesis lárugẹ nípasẹ̀ ọ̀nà tí ó ní ìmọ̀lára sí àwọn antagonists olugba M3 tí a yàn tàbí M3 siRNA.
AChE ni ibi-afẹde molikula ti DEET. Awọn oogun bii donepezil, ti o ṣiṣẹ bi awọn oludena AChE, le mu angiogenesis EC ṣiṣẹ ni vitro ati ninu awọn awoṣe ischemia hindlimb eku14. A ṣe idanwo ipa ti awọn ifọkansi DEET meji lori iṣẹ ṣiṣe enzyme AChE ni HUVEC. Awọn ifọkansi DEET kekere (10-8 M) ati giga (10-5 M) dinku iṣẹ ṣiṣe endothelial AChE ni akawe si awọn ipo iṣakoso (Fig. 2).
Àwọn ìfojúsùn DEET méjèèjì (10-8 M àti 10-5 M) dín ìṣiṣẹ́ acetylcholinesterase kù lórí HUVEC. A lo BW284c51 (10-5 M) gẹ́gẹ́ bí ìṣàkóso fún àwọn inhibitors acetylcholinesterase. Àwọn àbájáde ni a fihàn gẹ́gẹ́ bí ìpín ọgọ́rùn-ún ti iṣẹ́ AChE lórí HUVEC tí a tọ́jú pẹ̀lú àwọn ìfojúsùn méjì ti DEET ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a tọ́jú fún ọkọ̀. Àwọn ìye náà ni a fihàn gẹ́gẹ́ bí ìwọ̀n ± SEM ti àwọn ìwádìí òmìnira mẹ́fà. *p < 0.05 ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣàkóso (ìdánwò ìfiwéra Kruskal-Wallis àti Dunn).
Nitric oxide (NO) ní ipa nínú ilana angiogenic 33, nítorí náà, a ṣe àyẹ̀wò ìṣẹ̀dá NO nínú àwọn HUVEC tí DEET mú ṣiṣẹ́. Ìṣẹ̀dá endothelial tí a tọ́jú DEET NO pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì ìṣàkóso, ṣùgbọ́n ó dé pàtàkì ní ìwọ̀n 10-8 M nìkan (Àwòrán 3c). Láti pinnu àwọn àyípadà molikula tí ó ń ṣàkóso ìṣẹ̀dá NO tí DEET fà, a ṣe àyẹ̀wò ìfihàn eNOS àti ìṣiṣẹ́ nípasẹ̀ Western blotting. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìtọ́jú DEET kò yí ìfihàn eNOS padà, ó mú kí phosphorylation eNOS pọ̀ sí i ní ibi tí ó ń ṣiṣẹ́ (Ser-1177) nígbà tí ó ń dín ibi tí ó ń dènà kù (Thr-495) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kò tọ́jú nínú eNOS phosphorylation (Àwòrán 3d). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a ṣírò ìpíndọ́gba eNOS tí a phosphorylated ní ibi tí a ti ń ṣiṣẹ́ àti ibi tí a ti ń dènà lẹ́yìn tí a ti ṣe àtúnṣe iye eNOS tí a phosphorylated sí iye gbogbo enzyme. Ìpíndọ́gba yìí pọ̀ sí i ní pàtàkì nínú àwọn HUVEC tí a tọ́jú pẹ̀lú ìfọkànsí DEET kọ̀ọ̀kan ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a kò tọ́jú (Àwòrán 3d).
Níkẹyìn, a ṣe àyẹ̀wò ìfarahàn VEGF, ọ̀kan lára àwọn ohun pàtàkì tí ó ń fa ìfàsẹ́yìn, nípasẹ̀ Western blotting. DEET mú kí ìfarahàn VEGF pọ̀ sí i ní pàtàkì, nígbà tí pFHHSiD dí ìfarahàn yìí pátápátá.
Níwọ́n ìgbà tí àwọn ipa DEET ní í ṣe pẹ̀lú ìdínà oògùn àti ìdínkù àwọn olugba M3, a dán àbá náà wò pé DEET lè mú kí àmì calcium pọ̀ sí i. Lọ́nà ìyanu, DEET kùnà láti mú kí calcium cytoplasmic pọ̀ sí i nínú HUVEC (ìwádìí tí a kò fi hàn) àti HEK/M3 (Àwòrán 4a, b) fún àwọn ìfọ́pọ̀ méjèèjì tí a lò.
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Oṣù Kejìlá-30-2024