Oogun anthelmintic N, N-diethyl-m-toluamide (DEET) ti royin lati dẹkun AChE (acetylcholinesterase) ati pe o ni awọn ohun-ini carcinogenic ti o pọju nitori iṣọn-ẹjẹ ti o pọju. Ninu iwe yii, a fihan pe DEET ṣe pataki awọn sẹẹli endothelial ti o ṣe igbelaruge angiogenesis, nitorinaa jijẹ idagbasoke tumo. DEET ṣiṣẹ awọn ilana cellular ti o yori si angiogenesis, pẹlu afikun, ijira, ati adhesion. Eyi ni nkan ṣe pẹlu iṣelọpọ KO pọ si ati ikosile VEGF ninu awọn sẹẹli endothelial. Silencing ti M3 tabi lilo awọn inhibitors M3 elegbogi ti paarẹ gbogbo awọn ipa wọnyi, ni iyanju pe angiogenesis ti o fa DEET jẹ ifaramọ M3. Awọn idanwo ti o kan ifihan agbara kalisiomu ni endothelial ati awọn sẹẹli HEK ti o nfi awọn olugba M3 pọ si, bakanna bi abuda ati awọn ikẹkọ docking, fihan pe DEET n ṣiṣẹ bi modulator allosteric ti awọn olugba M3. Pẹlupẹlu, DEET ṣe idiwọ AChE, nitorinaa jijẹ bioavailability ti acetylcholine ati isopọmọ si awọn olugba M3, ati imudara awọn ipa proangiogenic nipasẹ ilana allosteric.
Awọn EC akọkọ ti ya sọtọ si aorta ti awọn eku Swiss. Ọna isediwon naa ni ibamu lati ilana Kobayashi 26. Murine ECs ti wa ni gbin ni EBM-2 alabọde ni afikun pẹlu 5% ti ko ṣiṣẹ FBS ti ooru titi di igba kẹrin.
Ipa ti awọn ifọkansi meji ti DEET lori ilọsiwaju ti HUVEC, U87MG, tabi BF16F10 ni a ṣe atupale nipa lilo CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Ni ṣoki, awọn sẹẹli 5.103 fun kanga ni a ti gbin ni awo-daradara 96, ti a gba laaye lati somọ ni alẹ, ati lẹhinna mu pẹlu DEET fun wakati 24. Lẹhin yiyọ alabọde idagba, ṣafikun ojutu abuda awọ si kanga microplate kọọkan ki o si ṣafikun awọn sẹẹli ni 37 °C fun awọn iṣẹju 30. Awọn ipele Fluorescence ni a pinnu nipa lilo oluka microplate Mithras LB940 multimode (Awọn imọ-ẹrọ Berthold, Bad Wildbad, Jẹmánì) ti o ni ipese pẹlu awọn asẹ ayọ 485 nm ati awọn asẹ itujade 530 nm.
Awọn irugbin HUVEC ni awọn awo-daradara 96 ni iwuwo ti awọn sẹẹli 104 fun kanga kan. A ṣe itọju awọn sẹẹli pẹlu DEET fun awọn wakati 24. A ṣe ayẹwo ṣiṣeeṣe sẹẹli nipa lilo ayẹwo MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). Awọn iye iwuwo opitika ni a gba lori oluka microplate multimode (Mithras LB940) ni gigun ti 570 nm.
Awọn ipa ti DEET ni a ṣe iwadi nipa lilo awọn idanwo angiogenesis in vitro. Itọju pẹlu 10-8 M tabi 10-5 M DEET pọ si dida ipari ti capillary ni awọn HUVECs (Fig. 1a, b, awọn ọpa funfun). Ti a bawe pẹlu ẹgbẹ iṣakoso, itọju pẹlu awọn ifọkansi DEET ti o wa lati 10-14 si 10-5 M fihan pe ipari capillary ti de ibi pẹtẹlẹ ni 10-8 M DEET (Afikun Fig. S2). Ko si iyatọ nla ti a rii ni ipa proangiogenic in vitro ti HUVEC ti a tọju pẹlu DEET ni iwọn ifọkansi ti 10-8 M ati 10-5 M.
Lati pinnu ipa ti DEET lori neovascularization, a ṣe ni awọn ikẹkọ neovascularization vivo. Lẹhin awọn ọjọ 14, awọn eku itasi pẹlu awọn sẹẹli endothelial ti a ti ṣaju pẹlu 10-8 M tabi 10-5 M DEET ṣe afihan ilosoke pataki ninu akoonu haemoglobin (Fig. 1c, awọn ifi funfun).
Pẹlupẹlu, DEET-induced neovascularization ni a ṣe iwadi ni awọn eku U87MG xenograft ti o ni itọsi lojoojumọ (ip) pẹlu DEET ni iwọn lilo ti a mọ lati fa awọn ifọkansi pilasima ti 10-5 M, eyiti o jẹ deede ni awọn eniyan ti o han. ni 23. Awọn èèmọ wiwa (ie èèmọ> 100 mm3) ni a ṣe akiyesi awọn ọjọ 14 lẹhin abẹrẹ ti awọn sẹẹli U87MG sinu awọn eku. Ni ọjọ 28, idagbasoke tumo ti ni ilọsiwaju ni pataki ni awọn eku ti a ṣe itọju DEET ni akawe pẹlu awọn eku iṣakoso (Fig. 1d, squares). Pẹlupẹlu, CD31 idoti ti awọn èèmọ fihan pe DEET ni pataki pọ si agbegbe capillary ṣugbọn kii ṣe iwuwo microvessel. (Fig. 1e-g).
Lati pinnu ipa ti awọn olugba muscarinic ni DETA-induced proliferation, 10-8 M tabi 10-5 M DETA ni iwaju pFHHSiD (10-7 M, yiyan M3 antagonist) ti a lo. Itoju ti HUVEC. pFHHSiD dina patapata awọn ohun-ini imudara ti DETA ni gbogbo awọn ifọkansi (Table 1).
Labẹ awọn ipo wọnyi, a tun ṣe ayẹwo boya DEET yoo ṣe alekun gigun capillary ninu awọn sẹẹli HUVEC. Bakanna, pFHHSiD ṣe idilọwọ ni pataki gigun ti DEET-induced capillary (Fig. 1a, b, awọn ọpa grẹy). Pẹlupẹlu, awọn adanwo ti o jọra ni a ṣe pẹlu M3 siRNA. Botilẹjẹpe siRNA ti iṣakoso ko munadoko ni igbega iṣelọpọ ti capillary, ipalọlọ ti olugba muscarin M3 ti paarẹ agbara DEET lati mu gigun capillary pọ si (Fig. 1a, b, awọn ifi dudu).
Pẹlupẹlu, mejeeji 10-8 M tabi 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro ati neovascularization in vivo ti dina patapata nipasẹ pFHHSiD (Fig. 1c, d, Circles). Awọn abajade wọnyi fihan pe DEET ṣe igbega angiogenesis nipasẹ ipa ọna ti o ni ifarabalẹ si yiyan M3 antagonists olugba tabi M3 siRNA.
AChE jẹ ibi-afẹde molikula ti DEET. Awọn oogun bii donepezil, eyiti o ṣiṣẹ bi awọn inhibitors AChE, le ṣe iwuri EC angiogenesis in vitro ati ni awọn awoṣe ischemia hindlimb eku 14. A ṣe idanwo ipa ti awọn ifọkansi meji ti DEET lori iṣẹ ṣiṣe enzymu AChE ni HUVEC. Irẹwẹsi (10-8 M) ati giga (10-5 M) awọn ifọkansi ti DEET dinku iṣẹ endothelial AChE ni akawe si awọn ipo iṣakoso (Fig. 2).
Awọn ifọkansi mejeeji ti DEET (10-8 M ati 10-5 M) dinku iṣẹ ṣiṣe acetylcholinesterase lori HUVEC. BW284c51 (10-5 M) ni a lo bi iṣakoso fun awọn inhibitors acetylcholinesterase. Awọn abajade jẹ afihan bi ipin ogorun iṣẹ AChE lori HUVEC ti a tọju pẹlu awọn ifọkansi meji ti DEET ni akawe si awọn sẹẹli ti a tọju ọkọ. Awọn iye ṣe afihan bi itumọ ± SEM ti awọn adanwo ominira mẹfa. * p <0.05 akawe si iṣakoso (Kruskal-Wallis ati Dunn ọpọ lafiwe igbeyewo).
Nitric oxide (NO) ṣe alabapin ninu ilana angiogenic 33, nitorinaa, KO iṣelọpọ ni awọn HUVEC ti o ni itara ti DEET ni a ṣe iwadi. DEET-ṣe itọju endothelial KO iṣelọpọ pọ si ni akawe si awọn sẹẹli iṣakoso, ṣugbọn o de pataki nikan ni iwọn lilo 10-8 M (Fig. 3c). Lati pinnu awọn iyipada molikula ti n ṣakoso DEET-induced KO iṣelọpọ, ikosile eNOS ati imuṣiṣẹ ni a ṣe atupale nipasẹ didi Oorun. Botilẹjẹpe itọju DEET ko paarọ ikosile eNOS, o pọ si iNOS phosphorylation ni pataki ni aaye ti n ṣiṣẹ (Ser-1177) lakoko ti o dinku aaye inhibitory rẹ (Thr-495) ni akawe si awọn sẹẹli ti ko ni itọju ni eNOS phosphorylation (Fig. 3d). Pẹlupẹlu, ipin ti eNOS phosphorylated phosphorylated ni aaye imuṣiṣẹ ati aaye inhibitory ni a ṣe iṣiro lẹhin deedee iye eNOS phosphorylated si apapọ iye enzymu. Iwọn yii pọ si ni pataki ni awọn HUVEC ti a tọju pẹlu ifọkansi kọọkan ti DEET ni akawe si awọn sẹẹli ti ko ni itọju (Fig. 3d).
Nikẹhin, ikosile ti VEGF, ọkan ninu awọn ifosiwewe proangiogenic akọkọ, ni a ṣe atupale nipasẹ didi Oorun. DEET pọsi ikosile VEGF ni pataki, lakoko ti pFHHSiD ṣe idiwọ ikosile yii patapata.
Niwọn bi awọn ipa ti DEET jẹ ifarabalẹ si idena elegbogi mejeeji ati isọdọtun ti awọn olugba M3, a ṣe idanwo idawọle pe DEET le mu ami ifihan kalisiomu pọ si. Iyalenu, DEET kuna lati mu kalisiomu cytoplasmic ni HUVEC (data ko han) ati HEK / M3 (Fig. 4a, b) fun awọn ifọkansi mejeeji ti a lo.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu kejila-30-2024