Àwọn oògùn apakòkòrò ń kó ipa pàtàkì nínú bíbójútó àìtó oúnjẹ kárí ayé àti bíbójútó àwọn àrùn ènìyàn tí a ń gbé kiri láti inú vector. Síbẹ̀síbẹ̀, ìṣòro tó ń pọ̀ sí i nípa ìdènà àwọn oògùn apakòkòrò nílò kíákíá láti rí àwọn èròjà tuntun tí wọ́n ń fojú sí àwọn ibi tí a kò lò dáadáa. Àwọn ikanni agbára ìgbàlódé ti kòkòrò (TRPV)—Nanzhong (Nan) àti aláìṣiṣẹ́ (Iav)—lè ṣẹ̀dá àwọn ikanni heterologous (Nan-Iav) kí wọ́n sì wà ní àyíká àwọn ẹ̀yà ara ẹ̀rọ tí ó ń ṣe àtúnṣe geotropism, ìgbọ́ràn, àti ìfàmọ́ra nínú àwọn kòkòrò. Àwọn oògùn apakòkòrò kan, bíi aphidopyrrolidone (AP), dojúkọ Nan-Iav nípasẹ̀ àwọn ọ̀nà tí a kò mọ̀. AP munadoko lòdì sí àwọn kòkòrò tí ń fa omi (hemipterans), ó ń dènà fífúnni ní oúnjẹ nípa dídí iṣẹ́ àwọn filaments náà lọ́wọ́. AP lè so mọ́ Nan nìkan, ṣùgbọ́n Nan-Iav nìkan ló lè bá àwọn agonists lò, títí kan endogenous nicotinamide (NAM), nípa bẹ́ẹ̀ ó ń fi iṣẹ́ ikanni hàn. Láìka agbára Nan-Iav gẹ́gẹ́ bí ibi tí a ń fojú sí, a kò mọ̀ púpọ̀ nípa ìṣọ̀kan ikanni rẹ̀, àwọn ibi ìdènà ìlànà, àti ìlànà Ca2+-tí ó dúró lórí rẹ̀, èyí tí ó ń dí ìdàgbàsókè àwọn oògùn apakòkòrò lọ́wọ́. Nínú ìwádìí yìí, a lo ìwádìí cryo-electron microscopy láti mọ ìṣètò Nan-Iav nínú àwọn kòkòrò Hemiptera ní ipò tí kò ní calmodulin-ligand, àti pẹ̀lú AP àti NAM ní ààlà ankyrin repeat cytoplasmic domain (ARD). Lọ́nà ìyanu, a rí i pé amuaradagba Nan fúnra rẹ̀ lè ṣẹ̀dá pentamer, èyí tí ó dúró ṣinṣin nípasẹ̀ ìbáṣepọ̀ ARD tí AP ṣe. Ìwádìí yìí fi ìbáṣepọ̀ mọ́lẹ́kúlù hàn láàrín àwọn kòkòrò àti àwọn agonists àti Nan-Iav, ó tẹnu mọ́ pàtàkì ARD nínú iṣẹ́ ikanni àti ìdàpọ̀, àti ṣíṣàwárí ìlànà ìṣètò Ca2+.
Lójú àbájáde ìyípadà ojúọjọ́ ayé tó ń pọ̀ sí i, àìlera oúnjẹ kárí ayé tó ń burú sí i jẹ́ ọ̀kan lára àwọn ìpèníjà pàtàkì ní ọ̀rúndún kọkànlélógún, pẹ̀lú àbájáde tó ń pọ̀ sí i fún àwùjọ.1,2Ìròyìn Ìpele Ààbò Oúnjẹ àti Oúnjẹ ní Àgbáyé ti Àjọ Ìlera Àgbáyé ti ọdún 2023 (SOFI) ṣírò pé nǹkan bí ènìyàn bílíọ̀nù 2.33 kárí ayé ló ń jìyà àìní oúnjẹ tó wọ́pọ̀ sí èyí tó le koko, ìṣòro tó ti wà fún ìgbà pípẹ́.3,4Ó bani nínú jẹ́ pé, a fojú díwọ̀n pé 20% sí 30% tàbí jù bẹ́ẹ̀ lọ nínú èso oko ni àwọn kòkòrò àti àwọn kòkòrò àrùn ń pàdánù lọ́dọọdún, a sì retí pé ìgbóná ayé yóò mú kí àìfaradà àwọn kòkòrò àti àìfaradà àwọn ohun ọ̀gbìn pọ̀ sí i.4,5,6,7,8Ìdàgbàsókè àwọn egbòogi kò ṣe pàtàkì láti dáàbò bo àwọn ohun ọ̀gbìn kúrò lọ́wọ́ àwọn kòkòrò àti láti dín ìtànkálẹ̀ àwọn kòkòrò tí ó ń gbé nípasẹ̀ vector kù nìkan, ṣùgbọ́n láti gbógun ti àwọn àrùn ènìyàn tí vector ń gbé nípasẹ̀ vector bí ibà dengue, ibà iba, àti àrùn Chagas, tí ó ń gbógun ti àwọn egbòogi tí ó ń gbógun ti sí i.5,9,10,11
Láàrín àwọn ibi pàtàkì tí àwọn oògùn apanirun tí ó léwu ń fojú sí, ikanni TRPV heterotetrameric Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) dúró fún àwọn ibi tí a ti rí àwọn oògùn apanirun ní ọdún mẹ́wàá sẹ́yìn, títí kan àwọn oògùn apanirun tí ó wà ní ọjà bíi imidacloprid àti pyraclostrobin.12, 13, 14Aphidopyrrolifen (AP) jẹ́ ọjà tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ tí a sì ti tà, èyí tí èròjà pàtàkì rẹ̀ jẹ́ Inscalis®, tí ó so AP pọ̀ ní ìpele ìṣiṣẹ́ subnanomolar.15AP ní ìpalára tó kéré síi fún àwọn ohun tí ń fa ìdọ̀tí, àwọn kòkòrò tó ń ṣe àǹfààní, àti àwọn ohun alààyè mìíràn tí kì í ṣe ohun tí a lè fojú sí, nígbà tí a bá sì lò ó gẹ́gẹ́ bí ìlànà àkọlé, ó lè dín ìfúnpá àwọn kòkòrò mìíràn kù.16, 17, 18Nan àti Iav tàn káàkiri gbogbo àwọn ẹ̀yà kòkòrò, wọ́n sì máa ń fara hàn nínú àwọn neuron receptor chordal stretch ti antennae àti àwọn ẹ̀gbẹ́, wọ́n sì ṣe pàtàkì fún gbígbọ́, rírí agbára òògùn, àti ìfarahàn.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, àti pyraclostrobin ń ru ìdàpọ̀ Nan-Iav sókè nípasẹ̀ ìlànà àrà ọ̀tọ̀ kan, nígbẹ̀yìn-gbẹ́yín ó ń dí ìfàsẹ́yìn àmì ìfàsẹ́yìn lọ́wọ́.13, 16, 23Nínú àwọn kòkòrò tí ń fa omi (hemipterans) bíi aphids àti whiteflies, pípadánù ìfarahàn ara ẹni máa ń ba agbára oúnjẹ wọn jẹ́, èyí sì máa ń yọrí sí ikú nígbẹ̀yìn-gbẹ́yín.13,24Ó yani lẹ́nu pé AP ní ìfẹ́ gíga fún ìdàpọ̀ Nan-Iav àti ìfẹ́ kékeré fún Nan nìkan. Ìsopọ̀ AP sí Nan-Iav máa ń fa ìṣàn iná mànàmáná, ṣùgbọ́n ìsopọ̀ mọ́ Nan nìkan kò ní mú kí ìṣiṣẹ́ ikanni ṣiṣẹ́. Iav fúnra rẹ̀ kò so mọ́ AP rárá.16Èyí fihàn pé Nan àti Iav lè so pọ̀ láti ṣẹ̀dá onírúurú àkójọpọ̀ ikanni Nan-Iav (fún àpẹẹrẹ, pẹ̀lú àwọn ìpíndọ́gba stoichiometric tó yàtọ̀ tàbí àwọn ìṣètò tó yàtọ̀ láàrín ìpíndọ́gba stoichiometric kan náà) tàbí pé AP lè so pọ̀ mọ́ ọ̀pọ̀lọpọ̀ ibi. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, nicotinamide adayeba (NAM) so mọ́ Drosophila Nan-Iav pẹ̀lú ìfàmọ́ra micromolar, ó sì ń fi àwọn ipa tó jọ ti àwọn aphids (AP) hàn nínú vitro.16,25àti dí ìbímọ àti jíjẹ àwọn ọ̀daràn aphid lọ́wọ́, èyí tó yọrí sí ikú wọn nígbẹ̀yìn gbẹ́yín25,26. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí gbé ọ̀pọ̀ ìbéèrè dìde. Fún àpẹẹrẹ, kò tí ì yé kedere bí a ṣe ń ṣe heterodimer Nan-Iav, àwọn ibi ìsopọ̀ wo ni a ń lò láti ṣe àtúnṣe àwọn molecule kékeré, àti bí àwọn molecule kékeré wọ̀nyí ṣe ń ṣe àkóso iṣẹ́ ikanni nípa dídínà proprioception. Síwájú sí i, àwọn ìdí tí Nan fúnrarẹ̀ kò fi ṣiṣẹ́ tí ó sì ní ìfẹ́ díẹ̀ fún AP, nígbà tí heterodimer Nan-Iav ń ṣiṣẹ́ tí ó sì so AP pọ̀ pẹ̀lú ìfẹ́ gíga, kò tí ì yé kedere. Níkẹyìn, a kò mọ púpọ̀ nípa ìlànà Ca2+-dependent ti iṣẹ́ Nan-Iav àti bí a ṣe ń so ó pọ̀ mọ́ àwọn ìlànà ìfàmìsí neuronal.. 13,21
Nínú ìwádìí yìí, tí a so mọ́ cryo-electron microscopy, electrophysiology, àti radioligand diassociation, a ṣàlàyé ìṣọ̀kan Nan-Iav àti ìlànà ìsopọ̀ rẹ̀ mọ́ àwọn olùṣàkóso molecule kékeré. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a ṣàwárí calmodulin (CaM) tí a so mọ́ àwọn pentamers Iav àti AP-stabilized. Àwọn àbájáde wọ̀nyí fún wa ní òye pàtàkì nípa ìṣètò àwọn ion calcium nínú àwọn ikanni, ìṣọ̀kan ikanni, àti àwọn ohun tí ó ń pinnu ìbáṣepọ̀ ligand diassociation. Èyí tí ó ṣe pàtàkì jùlọ ni pé, a jẹ́rìí sí i pé ARD ń kó ipa pàtàkì nínú àwọn ìlànà wọ̀nyí. Ìkẹ́kọ̀ọ́ wa nípa àwọn ikanni kòkòrò pípé tí a so mọ́ àwọn oògùn apakòkòrò ogbin tí ó yẹ.27, 28, 29Ó ṣí àwọn àǹfààní sílẹ̀ fún ìdàgbàsókè ilé iṣẹ́ àwọn egbòogi, ó ń mú kí iṣẹ́ àti ìpele pàtó ti àwọn egbòogi náà sunwọ̀n síi, ó sì ń jẹ́ kí a lo àwọn èròjà tí a fojú sí TRPV sí àwọn irúgbìn mìíràn láti kojú ààbò oúnjẹ àgbáyé àti ìtànkálẹ̀ àwọn àrùn tí a ń gbé kiri láti inú vector.
A tún rí i pé Ca2+ ni ó ń darí Nan-Iav, àti pé CaM tí a so mọ́ ara rẹ̀ jẹ́ ti ìṣàkóso ìlànà. Pàtàkì ni pé, ìlànà Ca2+-tí ó sinmi lórí Nav yìí láti ọwọ́ CaM yàtọ̀ sí àwọn ìlànà ìṣàkóso àwọn ikanni ion mìíràn (fún àpẹẹrẹ, àwọn ikanni Na+ tí a fi folti ṣe àti àwọn ikanni TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Nínú ikanni Nav1.2, agbègbè C-terminal ti CaM ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú agbègbè C-terminal (CTD), Ca2+ sì ń fa ìsopọ̀ agbègbè N-terminal rẹ̀ mọ́ apá jíjìn ti CTD56Nínú ikanni TRPV5/6, agbègbè C-terminal ti CaM so mọ́ CTH, Ca2+ sì fa ìfàsẹ́yìn sókè ti agbègbè N-terminal rẹ̀ sínú ihò náà, èyí sì ń dí ìfàsẹ́yìn cation lọ́wọ́53,54. A dámọ̀ràn àpẹẹrẹ kan fún iṣẹ́ tí Nan-Iav-CaM ń ṣe àkóso Ca2+ (Àwòrán 4h). Nínú àwòṣe yìí, agbègbè N-terminal ti CaM máa ń so mọ́ agbègbè C-terminal (CTH) ti Iav nígbà gbogbo. Nínú ipò ìsinmi (ìwọ̀n [Ca2+] díẹ̀), agbègbè C-terminal ti CaM máa ń bá Nan ṣe pọ̀, ó máa ń mú kí ìrísí ARD dúró ṣinṣin, ó sì máa ń mú kí ṣíṣí ikanni pọ̀ sí i. Dídìpọ̀ agonist/insecticide sí ikanni náà máa ń fa ṣíṣí ihò, èyí sì máa ń yọrí sí ìṣàn Ca2+. Lẹ́yìn náà, Ca2+ máa ń so mọ́ CaM, èyí sì máa ń fa ìpínyà agbègbè C-terminal kúrò nínú ARD ti Nan. Nítorí pé dídínà ìdènà CaM mú kí ipa ìdíwọ́ ti Ca2+ parẹ́, ìpínyà yìí máa ń yí ìṣíkiri ARD padà, èyí sì máa ń fa ìdíwọ́ tàbí àìsí ìmọ̀lára tó dúró lórí Ca2+. Ìmúpadà kíákíá ti àwọn ìṣàn ikanni lẹ́yìn ìtújáde ion calcium (Àwòrán 4g) fihàn pé ìlànà yìí ń mú kí ìdáhùn kíákíá sí àwọn àmì neuronal tí Ca2+ ń ṣe àkóso rọrùn. Síwájú sí i, a ti ròyìn pé agbègbè C-terminal ti Iav, tí a kò tíì lóye dáadáa, ń kó ipa mìíràn nínú ìfojúsùn ikanni àti ìlànà lọ́wọ́lọ́wọ́.21
Níkẹyìn, ìwádìí wa gbé ìṣètò gíga ti ẹ̀ka TRP ti a fi ń pa kokoro-arun-ara-ẹni tí ó ṣe pàtàkì fún iṣẹ́-ogbin kalẹ̀—àwárí kan tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀. Ní pàtàkì, a ṣe àfihàn ìṣètò àti iṣẹ́ ti ikanni kokoro ninu awọn sẹ́ẹ̀lì ènìyàn (HEK293S GnTi–) dípò nínú awọn sẹ́ẹ̀lì kokoro. Ní ojú ìdènà kokoro-arun tí ń pọ̀ sí i àti ìfúnpá tí ń bá a lọ lórí ààbò oúnjẹ àti àwọn àkóràn, iṣẹ́ wa ń pese ìwífún pàtàkì tí yóò mú kí ìdàgbàsókè àwọn kokoro-arun tuntun rọrùn fún àǹfààní ìlera ènìyàn àti ààbò oúnjẹ kárí ayé. Àwọn ìwádìí ti fihàn pé àwọn kokoro-arun bíi AP munadoko sí àwọn kòkòrò kan nígbà tí a bá lò wọ́n gẹ́gẹ́ bí ìlànà àkọlé àti pé wọ́n ní ìpalára líle koko sí àwọn ohun tí ń fa ìdọ̀tí, èyí tí ó ń fi ààbò àyíká wọn hàn.13,16Síwájú sí i, ìdánwò àwọn ohun tí ó ń fa àwọn èròjà AP lórí àwọn efon ti fihàn pé wọ́n pàdánù agbára wọn láti fò nígbẹ̀yìn gbẹ́yín. Lílóye bí àwọn èròjà tí ń ṣe àtúnṣe wọ̀nyí ṣe so mọ́ Nan-Iav yóò mú kí àtúnṣe àwọn èròjà tí ó wà tẹ́lẹ̀ tàbí ìdàgbàsókè àwọn èròjà tuntun rọrùn fún ìdàgbàsókè àti ìdàgbàsókè tí ó túbọ̀ gbéṣẹ́ sí i.ṣe deedeeÌdènà àwọn kòkòrò. Ìwádìí wa fihàn pé ìbáṣepọ̀ Nan-Iav ARD ṣe pàtàkì kìí ṣe fún ṣíṣàkóso ìṣiṣẹ́ àwọn èròjà ara, àwọn ohun tí ń pa kòkòrò, àti Ca2+-CaM nìkan, ṣùgbọ́n fún ìpéjọpọ̀ ikanni pẹ̀lú. A dámọ̀ràn pé dídá ìpéjọpọ̀ heterodimer pẹ̀lú àwọn molecule kékeré dúró lè jẹ́ ọ̀nà àrà ọ̀tọ̀ àti ìlérí fún ṣíṣẹ̀dá àwọn inhibitors ikanni ion.
Nínú àwọn jíìnì orthologous mẹ́jọ, a yan àwọn jíìnì gígùn pípé ti ìgbẹ́ aláwọ̀ ilẹ̀ (Halyomorpha halys) Nanchung àti Inactive, èyí tí ó fi ìdúróṣinṣin tó dára hàn nínú àwọn ohun ìfọṣọ. Àwọn jíìnì tí a ṣẹ̀dá ni a ṣe àtúnṣe sí codon fún ìfarahàn ènìyàn, a sì fi ìfọwọ́sowọ́pọ̀ sínú vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) nípa lílo àwọn ibi ìdínà XhoI àti EcoRI. Èyí mú kí àwọn ìfọwọ́sowọ́pọ̀ náà wà ní férémù pẹ̀lú àwọn àmì C-terminal GFP-FLAG-10xHis àti mCherry-FLAG-10xHis, tí a fi HRC-3C protease (PPX) gé, èyí tí ó fún ni láàyè láti jẹ́ kí ó jẹ́ olómìnira.ikosileÀwọn àkọ́lé tí a lò láti ṣe àkójọpọ̀ Nanchung àti Inactive sínú ẹ̀rọ pBacMam ni àwọn wọ̀nyí:
A gba awọn aworan oni-nọ́ńbà ti awọn patikulu kọọkan lori ẹrọ oni-nọ́ńbà itanna gbigbe Titan Krios G2 (FEI) ti a fi kamẹra K3 ati àlẹ̀mọ́ agbara Gatan BioQuantum ṣe. A ṣiṣẹ ẹrọ oni-nọ́ńbà naa ni 300 keV, pẹlu eto agbara ti 20 eV, iwọn piksẹli apẹẹrẹ ti 1.08 Å/piksẹli (iwọn titobi ti 81,000x), ati iwọn defocus ti o wa lati -0.8 si -2.2 μm. Gbigbasilẹ fidio ni awọn fireemu 40 fun iṣẹju-aaya kan nipa lilo ẹrọ oni-nọ́ńbà Latitude S (Gatan) pẹlu iwọn lilo ti a yan ti 25 e–px−1 s−1, akoko ifihan ti 2.4 s, ati iwọn lilo apapọ ti o to 60 e–Å−2.
A ṣe àtúnṣe ìṣípo tí a fa láti inú ìtànṣán àti ìwọ̀n ìwọ̀n lórí fíìmù nípa lílo MotionCor2 nínú RELION 4.061. A ṣe ìṣirò pàrámítà ìyípadà ìyàtọ̀ (CTF) nínú cryoSPARC nípa lílo ọ̀nà ìṣirò CTF tí ó dá lórí patch-based CTF method 62. A yọ àwọn fọ́tòmicrographs pẹ̀lú ìpinnu ìfitónilétí CTF ≥4 Å kúrò nínú ìwádìí tó tẹ̀lé e. Lọ́pọ̀ ìgbà, a lo ìpín kékeré ti àwọn fọ́tòmicrographs 500–1000 fún yíyan àmì nínú cryoSPARC, lẹ́yìn náà a lo àwọn ìyípo 2D lẹ́yìn yíyọ láti gba àwòrán ìtọ́kasí tí ó ṣe kedere fún yíyan pátákì tí ó dá lórí àwòṣe. Lẹ́yìn náà, a yọ àwọn pátákì jáde nípa lílo àwọn àpótí ìdè 64-pixel àti binning oní-apá mẹ́rin. Ọ̀pọ̀ ìyípo ti ìpín 2D ni a ṣe láti yọ àwọn ẹ̀ka pátákì tí a kò fẹ́ kúrò. A tún àwòṣe 3D àkọ́kọ́ ṣe nípa lílo àtúnṣe ab initio àti àtúnṣe nípa lílo àtúnṣe tí kò sí ní ìrísí nínú cryoSPARC. A ṣe ìpín 3D nínú cryoSPARC tàbí RELION tí ó dá lórí ìrísí ARD. A kò rí ìyàtọ̀ pàtàkì ti àwọn agbègbè membrane. A lo ọ̀nà C1 àti C2 láti tún àwọn èròjà pátákó ṣe; a kà àwọn èròjà pátákó tí wọ́n ní ìpele C2 tí ó ga síi sí ìwọ̀n kan náà ní ìbámu pẹ̀lú C2, a sì kó wọn wọ inú RELION fún ìtúnṣe Bayesian. Lẹ́yìn náà, a gbé àwọn èròjà náà padà sí cryoSPARC fún ìtúnṣe ìkẹyìn tí kò ní ìrísí àti àtúnṣe agbègbè. Ìpinnu ìkẹyìn àti iye èròjà pátákó ni a fihàn nínú Táblì 1.
Nígbà tí a ń ṣe àgbékalẹ̀ àwọn pentamers Nan+AP, a ṣe àwárí onírúurú ọ̀nà láti mú kí ìyípadà àwọn agbègbè membrane sunwọ̀n síi (pàápàá agbègbè iho), bíi yíyọ àmì kúrò àti ìbòjú TMD. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìgbìyànjú wọ̀nyí kò já sí pàbó nítorí ìṣòro tó le koko ní agbègbè iho àti ìyàtọ̀ gbogbogbòò ti TMD. A ṣírò ìpinnu ìkẹyìn nípa lílo ìbòjú tí ọ̀nà ìṣiṣẹ́ tí kò bá ara mu ní cryoSPARC mú jáde láìfọwọ́sí, ní pàtàkì sí agbègbè ARD. Èyí ṣe àṣeyọrí ìpinnu gíga ju ti àwọn agbègbè membrane lọ (pàápàá jùlọ agbègbè VSLD).
Àwọn àpẹẹrẹ de novo àkọ́kọ́ ti àwọn àpẹẹrẹ apo ti àwọn kòkòrò Nanchung àti Inactive ni a kọ́kọ́ ṣẹ̀dá nípa lílo Coot63, àti àwọn àpẹẹrẹ ti àwọn kòkòrò Nan àti Iav ni a ṣẹ̀dá nípa lílo AlphaFold264 láti dá àwọn agbègbè tí kò ní ìgbẹ́kẹ̀lé. A gbé àwòrán Calmodulin kalẹ̀ lórí àwọn ìpele ara líle ti àwọn àpẹẹrẹ Ca2+-binding àti Ca2+-free nínú àwọn accessions PDB 4JPZ56 àti 1CFD65, lẹ́sẹẹsẹ. A ṣe àtúnṣe àwọn àpẹẹrẹ náà nípa lílo ìṣàtúnṣe spheric láti rí i dájú pé stereochemistry tó tọ́ àti geometry tó dára. Lẹ́yìn náà ni a ṣe àwòrán Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, àti phosphatidylserine gẹ́gẹ́ bí àwọn ìwọ̀n lipid tí a ti ṣàlàyé dáadáa, a sì gbé àwọn ligands NAM àti AP sí àwọn ìwọ̀n tí ó báramu nínú àwọn ìsopọ̀ tí ó nípọn. A ṣẹ̀dá àwọn fáìlì ìdíwọ́ láti inú okùn SMILES ti àwọn isoforms nípa lílo eLBOW nínú PHENIX66. Níkẹyìn, a ṣe àtúnṣe àwọn àpẹẹrẹ náà ní ààyè gidi ní PHENIX nípa lílo àwárí grid agbegbe àti ìdínkù àgbáyé pẹ̀lú àwọn ìdíwọ̀n ìṣètò kejì. A lo olupin MolProbity fun isọdọtun awoṣe ati itupalẹ eto, ati awọn aworan ni a ṣe nipa lilo PyMOL ati UCSF Chimera X. 67,68,69 A ṣe itupalẹ Aperture nipa lilo olupin HOLE,70 ati ṣiṣe maapu itoju lẹsẹsẹ nipa lilo olupin Consurf.71
A ṣe àgbéyẹ̀wò ìṣirò nípa lílo Igor Pro 6.2, Excel Office 365, àti GraphPad Prism 7.0. Gbogbo ìwádìí oníṣirò ni a gbé kalẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àṣìṣe ± ìwọ̀n (SEM). A lo ìdánwò t-test akẹ́kọ̀ọ́ (tí ó ní ìrù méjì, tí kò ní ìsopọ̀) láti fi àwọn ẹgbẹ́ méjì wéra. A lo àgbéyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan (ANOVA) lẹ́yìn náà ni a lo ìdánwò lẹ́yìn hoc Dunnett láti fi wé àwọn ẹgbẹ́ púpọ̀. *P< 0.05, **P< 0.01, àti ***PA kà < 0.001 sí pàtàkì ní ìṣirò ní ìbámu pẹ̀lú ìpínkiri dátà náà. A ṣírò àwọn iye Kd, Ki, àti àwọn àlàfo ìgbẹ́kẹ̀lé tí kò ṣe déédéé ti 95% wọn nípa lílo GraphPad Prism 10.
Fún àlàyé síi lórí ọ̀nà ìwádìí náà, jọ̀wọ́ wo Àkótán Ìròyìn Ìpolówó Ìṣẹ̀dá tí a so pọ̀ mọ́ àpilẹ̀kọ yìí.
A ṣe àwòṣe àkọ́kọ́ náà nípa lílo àwọn àwòṣe calmodulin láti inú ibi ìkópamọ́ data PDB 4JPZ àti 1CFD. A ti fi àwọn ìṣọ̀kan náà sí PDB lábẹ́ àwọn nọ́mbà ìfàsẹ́yìn 9NVN (Nan-Iav-CaM láìsí ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM tí a so mọ́ nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM tí a so mọ́ nicotinamide àti EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM tí a so mọ́ aphenidolpyrrolline àti calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM tí a so mọ́ aphenidolpyrrolline àti EDTA), àti 9NVS (Nan pentamer tí a so mọ́ aphenidolpyrrolline). Àwọn àwòrán onímọ̀-ẹ̀rọ-ìwòran cryo-electron tí ó báramu ni a gbé sínú Ibi Ìpamọ́ Electron Microscopy (EMDB) lábẹ́ àwọn nọ́mbà ìfàsẹ́yìn wọ̀nyí: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM láìsí ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM complex pẹ̀lú nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM complex pẹ̀lú nicotinamide àti EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM complex pẹ̀lú aphidopyrrolline àti calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM complex pẹ̀lú aphidopyrrolline àti EDTA), àti EMD-49849 (Nan pentamer complex pẹ̀lú aphidopyrrolline). Àwọn ìwádìí tí a kò rí tẹ́lẹ̀ fún ìwádìí iṣẹ́ ni a gbé kalẹ̀ nínú ìwé yìí.
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Jan-28-2026